綠色糖單孢菌復(fù)合胞外酶對(duì)紙漿的協(xié)同漂浮作用

綠色糖單孢菌復(fù)合胞外酶對(duì)紙漿的協(xié)同漂浮作用

通過化學(xué)處理得到的血漿有一定顏色，主要是由漿中的木素引起的。傳統(tǒng)的紙漿漂白是通過含氯化學(xué)品的作用除去紙漿中的木素或者改變木素發(fā)色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,具有漂劑價(jià)格低廉、對(duì)木素選擇性好等優(yōu)點(diǎn);但其漂白廢水嚴(yán)重污染環(huán)境,如常用的氯漂,其廢水就含有二惡英等大量強(qiáng)致癌性有機(jī)氯化物。紙漿生物酶漂白主要是利用微生物分泌的胞外酶處理紙漿,實(shí)現(xiàn)脫除木素或有利于脫除木素的過程。紙漿在化學(xué)漂白前先經(jīng)木聚糖酶助漂的生產(chǎn)工藝現(xiàn)已達(dá)到工業(yè)化水平,主要目的在于催化降解纖維細(xì)胞壁內(nèi)和沉積在纖維表面的木聚糖,以增加紙漿纖維的滲透性,使后續(xù)漂白的化學(xué)漂劑更易滲透到纖維內(nèi)部降解木素。木素過氧化物酶是一種高選擇性的木素降解酶,在微量H2O2存在的條件下,其才可直接斷裂紙漿中基于木素結(jié)構(gòu)的一系列發(fā)色和助色基團(tuán)。有研究報(bào)道,由木聚糖酶和木素過氧化物酶共同參與的協(xié)同漂白,可更加高效地去除紙漿中的木聚糖和木素發(fā)色、助色基團(tuán),進(jìn)一步減少后續(xù)漂白的化學(xué)漂劑用量及紙廠漂白廢水中有機(jī)氯化物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。近期研究表明,綠色糖單孢菌在特定的培養(yǎng)條件下可同時(shí)產(chǎn)生木聚糖酶和木素過氧化物酶,該復(fù)合胞外酶在80℃、pH值為8的條件下表現(xiàn)出的最高木聚糖酶活為45.14U/mL,相對(duì)于當(dāng)前廣泛研究的酸性低溫木聚糖酶,具有很好的耐熱嗜堿性能,更適用于紙漿漂白工段堿性高溫環(huán)境的要求。將該復(fù)合胞外酶應(yīng)用于紙漿漂白可去除紙漿中7.1%的木聚糖、11.0%的木素和39.2%的木素-碳水化合物復(fù)合體(LCC),并可初步提升紙漿白度3.2個(gè)百分點(diǎn),漂白效果顯著。目前生物酶漂白紙漿的研究主要集中在紙漿的漂白效果方面,對(duì)漂白機(jī)理的研究也僅限于單一酶漂白機(jī)理的探討。由一種菌同時(shí)產(chǎn)生的兩種酶協(xié)同降解紙漿中木聚糖和木素結(jié)構(gòu)的作用機(jī)理目前還未見報(bào)道。本研究主要采用掃描電鏡(SEM)、氣相色譜(GC)、紅外光譜(FT-IR)、固體核磁共振碳譜(CP/MAS13C-NMR)、X射線衍射儀(XRD)等儀器分析手段全面闡釋綠色糖單孢菌復(fù)合胞外酶協(xié)同漂白的作用機(jī)理。1實(shí)驗(yàn)1.1鹽法化學(xué)蒸煮原漿由產(chǎn)自山西省襄汾縣的速生三倍體毛白楊經(jīng)硫酸鹽法化學(xué)蒸煮制得,蒸煮條件及漿料性能見文獻(xiàn)。復(fù)合胞外酶(Sav)由波蘭引進(jìn)的綠色糖單孢菌在特定培養(yǎng)條件下培育產(chǎn)生,發(fā)酵條件及產(chǎn)酶規(guī)律、酶學(xué)特性見文獻(xiàn)。1.2-甲基蒂唑木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖,色譜純,Sigma;1-甲基咪唑,色譜純,Alfa;乙酸酐,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;肌醇,生化試劑,北京奧博星技術(shù)責(zé)任有限公司;其他試劑均為分析純,北京化學(xué)試劑公司。1.3紅外光譜測(cè)試日本HITACHI的SEM-520型掃描電鏡;美國(guó)Agilent6820型氣相色譜儀(糖醇乙酸酯化法);美國(guó)AgilentRFX-65型傅里葉紅外光譜儀;德國(guó)BrukerAV300型固體核磁共振波譜儀;日本Shimadzu6000型X射線衍射儀。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1最佳漂漂工藝條件的確定將緩沖溶液與原漿在聚乙烯袋中均勻混合后靜置30min,加入Sav和H2O2,置于設(shè)好溫度的恒溫水浴中反應(yīng),每隔15min將聚乙烯袋取出揉搓1次。至規(guī)定時(shí)間取出紙漿,用蒸餾水洗凈殘余酶液,在紙樣抄取器上獲得統(tǒng)一定量的漿片,自然風(fēng)干后供漿料分析測(cè)試使用。前期得出的最佳漂白工藝條件:復(fù)合胞外酶用量30U/g(以木聚糖酶計(jì)),pH值8,溫度80℃,時(shí)間120min,漿濃10%,H2O2用量0.1mmol/L。原漿白度32.6%,卡伯值13.0,特性黏度1170mL/g;Sav漂白漿白度35.8%,卡伯值11.7,特性黏度1190mL/g。1.4.2研磨木素mwl和lcc的提取紙漿中的MWL和LCC的提取均采用文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行。1.4.3關(guān)于漂白機(jī)的研究方法掃描電鏡、氣相色譜、紅外光譜、固體核磁共振、X射線衍射的分析方法均參見文獻(xiàn)。2結(jié)果與討論2.1原漿纖維的制備紙漿纖維表面的掃描電鏡照片如圖1所示。由圖1可以看出,原漿(A)纖維硬挺,表面較為光滑,無(wú)損傷,無(wú)裂隙;而Sav漂白漿(B)的纖維表面剝落現(xiàn)象非常明顯,存在局部裂隙,甚至出現(xiàn)大面積的溝槽,纖維結(jié)構(gòu)變得疏松。2.2木糖、葡萄糖、纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)氣相色譜分析以肌醇為內(nèi)標(biāo)物,原漿和Sav漂白漿的氣相色譜圖如圖2所示,根據(jù)內(nèi)標(biāo)法積分得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少,可間接反應(yīng)出紙漿中相應(yīng)聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降。Sav漂白漿的木糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降最多,相對(duì)原漿降幅20.5%,說(shuō)明Sav漂白主要作用于紙漿中的木聚糖;葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)有小幅下降,相對(duì)原漿降幅1.2%,葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降間接說(shuō)明紙漿中纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少,這主要是由于Sav中存在的微量纖維素酶降解纖維素所造成的;阿拉伯糖小幅下降,相對(duì)原漿降幅6.1%;而甘露糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)原漿有0.7%的小幅上升,原因在于其他聚糖被降解導(dǎo)致紙漿中的甘露聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)增加。2.3sav-c—紙漿木素的紅外光譜按照Bj?rkman的方法從原漿和Sav漂白漿中分別提取MWL,進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析,所得譜圖如圖3所示,譜圖解析見表2。原漿木素在1730cm-1處有吸收峰存在,證明在提取MWL時(shí)可能混雜微量的碳水化合物,而Sav漂白漿木素在1730cm-1處的吸收峰強(qiáng)度較原漿木素略大,說(shuō)明Sav漂白會(huì)引起紙漿中少量碳水化合物氧化,對(duì)纖維素有較小的破壞,這很可能與Sav中存在微量纖維素酶有關(guān);1664cm-1處的吸收峰為木素中具有對(duì)位取代基的共軛芳香酮,Sav漂白漿木素吸收峰的強(qiáng)度較原漿木素的有較明顯的上升,說(shuō)明Sav漂白會(huì)使紙漿殘余木素側(cè)鏈Cα氧化,生成α-羰基;同時(shí)從1085cm-1的吸收峰變化也可看到,仲醇羥基經(jīng)Sav漂白后減少,這些羥基主要來(lái)自α-羥基,被氧化后即生成α-羰基,而具有α-羰基的木素經(jīng)NaOH抽提會(huì)發(fā)生Cα—Cβ裂解,產(chǎn)生醛基或羧基,從而引起木素降解;2937cm-1和1380cm-1的吸收峰主要反映脂肪甲基、亞甲基的C—H伸縮振動(dòng),經(jīng)Sav漂白后均有明顯下降,可以推斷Sav漂白減少了木素的側(cè)鏈數(shù)目;在1595cm-1處的吸收峰是由苯環(huán)振動(dòng)和羰基伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的,但原漿木素在1595cm-1處的吸收峰在Sav漂白漿木素中檢測(cè)不到,說(shuō)明Sav漂白減少了木素的總羰基數(shù),這也說(shuō)明Sav漂白對(duì)紙漿中的殘余木素具有開環(huán)作用,這種反應(yīng)可能是從具有酚羥基結(jié)構(gòu)的木素開始。紅外光譜在1516～1508cm-1處是苯環(huán)骨架的振動(dòng),并且愈創(chuàng)木基型木素的吸收波數(shù)大于紫丁香基型。在此區(qū)間,原漿木素的吸收峰發(fā)生在1508cm-1處,而Sav漂白漿木素發(fā)生在1516cm-1處,說(shuō)明Sav漂白漿木素中保留較多的愈創(chuàng)木基型木素,更多的紫丁香基結(jié)構(gòu)木素被降解。此外,1340cm-1和1118cm-1處是紫丁香基苯環(huán)C—H振動(dòng)的吸收峰,Sav漂白漿木素相對(duì)吸收強(qiáng)度都較原漿木素有所下降,進(jìn)一步說(shuō)明Sav漂白更易降解紙漿殘余木素中的紫丁香基;1268cm-1處的吸收峰來(lái)自愈創(chuàng)木基型C==OC=Ο的伸縮振動(dòng),Sav漂白漿木素相對(duì)吸收峰強(qiáng)度的增大,也說(shuō)明由于Sav漂白降解紫丁香基,使愈創(chuàng)木基型木素的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。2.4sav-o-4木素降解及振動(dòng)信號(hào)將原漿和Sav漂白漿的MWL進(jìn)行固體核磁共振碳譜分析,所得譜圖如圖4所示,譜圖解析見表3。原漿木素的5-5′結(jié)構(gòu)δ在143.1處有吸收峰,而Sav漂白漿木素δ在143.1處的吸收峰減弱,推測(cè)Sav漂白可能對(duì)木素分子的5-5′結(jié)構(gòu),特別是酚型的5-5′結(jié)構(gòu)單元有降解作用;δ在119.1處為β-芳基醚中的愈創(chuàng)木基C6的共振信號(hào),Sav漂白漿木素的吸收峰較原漿增強(qiáng),說(shuō)明Sav漂白漿木素的愈創(chuàng)木基發(fā)生了氧化,使α-羰基增多;原漿木素δ在104.3處的吸收峰非常強(qiáng),但在Sav漂白漿木素中此峰明顯減弱,說(shuō)明Sav漂白容易降解木素的酚型紫丁香基;原漿木素δ在144.7、119.1處為β-芳基醚鍵的共振吸收峰,在Sav漂白漿木素中明顯減弱,說(shuō)明Sav漂白可以降解木素β-芳基醚鍵,可能發(fā)生環(huán)開裂反應(yīng);Sav漂白漿木素δ在86.1處的β-O-4連接基本消失,說(shuō)明Sav漂白可以有效地破壞木素最主要的β-O-4連接鍵;此外δ在86.1、69.8、53.0處β-β連接的共振信號(hào)明顯減弱,說(shuō)明β-β連接的木素單元也被生物降解了;但經(jīng)Sav漂白后,紙漿木素的一些縮聚型結(jié)構(gòu)仍然保留,如δ在152.0處的5-5′結(jié)構(gòu)和δ在35.0處的二苯乙烯結(jié)構(gòu),共振信號(hào)并沒有減弱,說(shuō)明非酚型的5-5′結(jié)構(gòu)和二苯乙烯結(jié)構(gòu)對(duì)Sav相當(dāng)穩(wěn)定。2.5sav、苯環(huán)以及苯環(huán)振動(dòng)對(duì)lcc活性的影響同樣按照Bj?rkman的方法從原漿和Sav漂白漿分別提取LCC,進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析,所得譜圖如圖5所示,譜圖解析見表4。3278cm-1處為O—H拉伸的特征吸收峰,Sav漂白漿中LCC峰值相對(duì)原漿增大,說(shuō)明Sav漂白使LCC中產(chǎn)生了新的羥基,羥基質(zhì)量分?jǐn)?shù)增多,對(duì)增加后續(xù)漂白時(shí)木素的反應(yīng)活性十分有利;1733cm-1處的吸收峰為羧基及其他脂的C==OC=Ο振動(dòng),Sav漂白漿中LCC峰值相對(duì)原漿有所下降,說(shuō)明Sav漂白對(duì)LCC中的木聚糖有降解作用;1640cm-1處的吸收峰為木素結(jié)構(gòu)中的共軛C==OC=Ο振動(dòng),Sav漂白漿中LCC峰值相對(duì)原漿增大,說(shuō)明Sav漂白使LCC中木素分子的C==OC=Ο增多;1502cm-1處和1421cm-1處的吸收峰均為苯環(huán)骨架振動(dòng),Sav漂白漿中LCC峰值相對(duì)原漿均有明顯下降,說(shuō)明Sav漂白使LCC中木素結(jié)構(gòu)的苯環(huán)有開環(huán)反應(yīng),苯環(huán)振動(dòng)減弱,可能使LCC中木素的酚型和非酚型均受到破壞;1380cm-1處的吸收峰為C—H振動(dòng),Sav漂白漿中LCC峰值相對(duì)原漿下降,說(shuō)明Sav漂白使LCC中的纖維素和半纖維素均發(fā)生了降解。2.6sav的穩(wěn)定機(jī)理為了具體闡明Sav漂白以何種方式斷裂紙漿LCC的化學(xué)連接,將原漿和Sav漂白漿的LCC進(jìn)行固體核磁共振碳譜分析,所得譜圖如圖6所示,譜圖解析見表5。δ在175.1處的吸收峰來(lái)自LCC中木素與碳水化合物之間的酯鍵連接,Sav漂白前后峰值基本相當(dāng),說(shuō)明Sav漂白不能斷裂LCC中木素與碳水化合物之間的酯鍵連接;δ在103.6處的吸收峰來(lái)自縮醛鍵型LCC結(jié)構(gòu),Sav漂白前后峰值幾乎沒有變化,說(shuō)明紙漿中與糖單元以縮醛鍵連接的縮醛鍵型LCC結(jié)構(gòu)對(duì)Sav十分穩(wěn)定;δ在85.4處的吸收峰來(lái)自β-β連接中的Cα、β-O-4中的Cβ以及與糖類有醚鍵連接的Cα,Sav漂白漿中LCC的峰值較原漿明顯減弱,說(shuō)明Sav漂白可以斷裂LCC中木素分子的β-O-4和β-β連接鍵,這與紙漿木素的核磁共振結(jié)果相符,同時(shí)還可能打斷LCC中木素與碳水化合物間的醚鍵連接;δ在65.2處的吸收峰主要來(lái)自LCC中的木聚糖結(jié)構(gòu),Sav漂白后此峰基本消失,說(shuō)明Sav漂白會(huì)大量降解LCC中的木聚糖;δ在63.2處為5-5′結(jié)構(gòu)與木聚糖新形成的以苯甲醚鍵連接的LCC結(jié)構(gòu)的吸收峰,Sav漂白漿中LCC的峰值較原漿略有增大,說(shuō)明Sav漂白對(duì)木素的一些縮合結(jié)構(gòu),如:Cα/Cβ(β-1)、Cγ(β-5、β-1、β-O-4)和β-木糖上的C5,沒有降解作用,同時(shí)在漂白過程中,還可能形成新的苯甲醚鍵型LCC;δ在55.6處為甲氧基的吸收峰,Sav漂白漿中LCC的峰值較原漿明顯減小,說(shuō)明Sav漂白使LCC中的木素與碳水化合物之間及內(nèi)部的化學(xué)鍵斷裂,降解產(chǎn)生的小分子木素和糖類大量溶出,使LCC中的木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)減小,另一方面也可說(shuō)明Sav漂白更易降解LCC中木素分子的紫丁香基結(jié)構(gòu),使漂后木素的紫丁香基相對(duì)比例減小,從而導(dǎo)致甲氧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。2.7晶度及晶度將原漿和Sav漂白漿分別進(jìn)行X射線衍射掃描,測(cè)定紙漿纖維素的結(jié)晶度,所得譜圖如圖7所示,計(jì)算得出的纖維素結(jié)晶度見表6。Sav漂白漿的結(jié)晶度為54.36%,相對(duì)原漿的51.31%有明顯上升,說(shuō)明紙漿經(jīng)Sav漂白后,纖維素的結(jié)晶區(qū)所占比例增大,即Sav漂白主要作用于紙漿纖維素的無(wú)定形區(qū),而對(duì)結(jié)晶區(qū)的破壞較少,初步推測(cè)這些變化部分來(lái)自于Sav中微量纖維素酶的作用,部分來(lái)自于木聚糖酶和木素過氧化物酶的協(xié)同漂白對(duì)紙漿LCC的降解。3木素分子的核磁共振結(jié)構(gòu)3.1通過紙漿纖維表面掃描電鏡照片可以看到,Sav漂白使紙漿的纖維表面剝落現(xiàn)象明顯,出現(xiàn)局部裂隙現(xiàn)象和大面積的溝槽,使纖維結(jié)構(gòu)變得疏松,有利于增強(qiáng)后續(xù)漂白中漂劑的滲透,改善化學(xué)漂白的脫木素效果。3.2通過氣相色譜分析可以看出,Sav漂白主要作用于紙漿中的木聚糖,對(duì)纖維素也有少量破壞。3.3由紙漿木素紅外光譜分析得出,Sav漂白使紙漿殘余木素側(cè)鏈Cα氧化,生成具有α-羰基的木素;減少了木素的側(cè)鏈數(shù)目和總羰基數(shù);會(huì)優(yōu)先降解殘余木素的紫丁香基結(jié)構(gòu);對(duì)殘余木素骨架具有開環(huán)作用,且可能是從具有酚羥基結(jié)構(gòu)的木素開始;同時(shí)還會(huì)氧化紙漿中的少量碳水化合物,對(duì)纖維素有較小的破壞作用。3.4通過紙漿木素核磁共振碳譜分析得出,Sav漂白主要斷裂木素分子的β-O-4和β-β連接鍵;對(duì)木素的β-芳基醚鍵也有一定的破壞作用,且可能是環(huán)開裂反應(yīng);容易降解木素分子的酚型紫丁香基;可部分降解一些縮聚型結(jié)構(gòu),如酚型5-5′結(jié)構(gòu)單元,但對(duì)非酚型的5-5′結(jié)構(gòu)和二苯乙烯結(jié)構(gòu)沒有降解作用。3.5由紙漿LCC紅外光譜分析得出,Sav漂白使LCC的羥基質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,以利于后續(xù)脫木素反應(yīng)的進(jìn)行;使LCC中木素分子的C==OC=Ο增多;對(duì)LCC中木素結(jié)構(gòu)的苯環(huán)具有開環(huán)作用,LCC中木素的酚型和非酚型均受到破