應(yīng)用dna法檢測全細(xì)胞酶和植酸酶

應(yīng)用dna法檢測全細(xì)胞酶和植酸酶

酶劑不僅可以提高飼料的消耗率和利用率，提高動物育種性能，而且可以減少動物飼料中的氮和磷排放，從而避免自然環(huán)境中的水體和土壤污染。因此，在21世紀(jì)，作為一種高效、無中毒、后現(xiàn)代的“綠色”飼料添加劑，飼料的使用具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，酶制劑在飼料、預(yù)混料中的酶活測定方法還不成熟，有些酶由于添加劑量小及飼料中各種干擾因子如重金屬離子等影響，實驗室測定非常困難，酶活測定結(jié)果變異較大。本試驗在預(yù)混料中添加以木聚糖酶為主的全細(xì)胞復(fù)合酶或植酸酶，通過不同方法分別測定預(yù)混料中的木聚糖酶酶活和植酸酶酶活，目的是探討預(yù)混料中酶活測定的優(yōu)化條件，從而為預(yù)混料中酶活的檢測提供新思路，為建立一種相對統(tǒng)一的檢測方法提供參考。1材料和方法1.1檢測酶的劑木聚糖酶：由康地恩集團以黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)，以木聚糖酶為主的全細(xì)胞復(fù)合酶；植酸酶：由康地恩集團生產(chǎn)的顆粒植酸酶制劑5000u/g。1.2養(yǎng)殖豬肉的質(zhì)量評定,可選用豬4.5、bv14p、dv14p豬2.由山東六和青島和美飼料有限公司提供。分別為青島和美LC633P蛋雞5%、LC15蛋雞5%、BC15肉小雞5%、BC35肉大雞5%、SB345豬4%、SB44P豬4%、LH660豬4%、EV24雞4%、BV15肉雞0.4%、DV14鴨0.4%、BV24肉雞0.4%。1.3酶活力的測定木聚糖酶：根據(jù)山東六和農(nóng)牧科技園企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/SLH002-2006，酶樣品于40℃，pH5.0條件下，1min水解木聚糖生成相當(dāng)于1μg木糖還原物質(zhì)，即為1個酶活力單位。植酸酶：根據(jù)GB/T6682-1992，樣品在植酸鈉濃度為5.0mmol/L、溫度37℃、pH值5.5的條件下，1min從植酸鈉中釋放1μmol無機磷，即為一個植酸酶活性單位。1.4酶活對照試驗1.4.1試驗分兩部分，一部分選擇預(yù)混料添加KDN全細(xì)胞酶，采用不同優(yōu)化辦法進行木聚糖酶酶活比較；另一部分選擇預(yù)混料添加植酸酶，采用不同優(yōu)化辦法進行植酸酶酶活比較。試驗設(shè)常規(guī)對照，即直接測定酶制劑樣品的木聚糖酶酶活或植酸酶酶活，作為100%絕對酶活與在預(yù)混料中測定酶活進行比較。簡要試驗方案如下：常規(guī)（對照組）：1g酶→溶解定容至100mL（稀釋緩沖液）容量瓶……試驗組：0.1g酶+5g預(yù)混料混勻（LC633P、LC15、BC15、BC35）→溶解定容……試驗組：0.1g酶+4g預(yù)混料混勻（SB34、SB44P、LH600、EV24）→溶解定容……試驗組：0.1g酶+0.4g預(yù)混料混勻（BV14、DV鴨、BV肉雞）→溶解定容……2結(jié)果與分析2.1糖酶活測定值由表1測定酶活結(jié)果可知，大多數(shù)預(yù)混料中木聚糖酶活實際測定值都集中在655561～766105u/g之間，實際測定酶活結(jié)果表明仍有0.3%～15%的酶活沒有測定出來。2.2edta2na4e由表2可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加KDN全細(xì)胞酶，在測定過程中添加6%的EDTA·2Na，使測定的木聚糖酶活提高12500u/g，即提高了1.3%。2.3木聚糖酶酶活的測定由表3可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加KDN全細(xì)胞酶，在測定過程中一次性稀釋到位測定，使得測定的木聚糖酶酶活提高48333u/g，即提高7.27%。2.4實際酶活測定值由表4測定酶活結(jié)果可知，大多數(shù)預(yù)混料中植酸酶酶活實際測定值都集中在4681～5911u/g，實際測定酶活表明仍有2.06%～22.44%的酶活沒有測定出來。2.5添加植酸酶，2%edta2na由表5可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加植酸酶，在測定過程中添加6%EDTA·2Na，可使測定的植酸酶酶活提高901u/g，即提高16.26%。2.6添加植酸酶，使測定檢測結(jié)果見表1由表6可知，預(yù)混料LC633P蛋雞5%添加植酸酶，在測定過程中一次性稀釋到位測定，使得測定的植酸酶酶活提高1105u/g，即提高19.91%。3預(yù)混料中酶活測定的改進試驗結(jié)果表明，測定過程中緩沖液添加6%的EDTA·2Na、一次性稀釋到位直接測定可以明顯提高預(yù)混料中木聚糖酶或植酸酶酶活的測定值，可以更客觀地反映預(yù)混料中添加的酶制劑的酶活含量。選用LC633P蛋雞5%預(yù)混料作為試驗材料，是由于該預(yù)混料測得的木聚糖酶酶活、植酸酶酶活最低，選擇此預(yù)混料進行酶活測定方法的優(yōu)化，更能說明添加6%EDTA·2Na或一次性稀釋到位可以明顯提高在預(yù)混料中的酶活實測值這個現(xiàn)象。添加6%EDTA·2Na使預(yù)混料中酶活實測值得到提高，原因是預(yù)混料中的一些重金屬離子與EDTA生成螯合物，減少了對酶蛋白的毒性影響；一次性稀釋到位法避開了分步稀釋法中的第一步稀釋中重金屬離子濃度太高對酶的毒性作用，可以提高預(yù)混料中酶活的測定值，而且添加酶進入飼料進入消化道也是一種一次性稀釋狀態(tài)，因此一次性稀釋到位測定酶活更加真實地反映了酶在動物消化道內(nèi)的實際情況，對生產(chǎn)更具有實際意義。此外，以上試驗也表明，酶制劑添加到預(yù)混料中測定酶活值變化較大，并不能說明酶制劑在預(yù)混料中失活，而是測定方法需