大、小鼠穿梭箱實驗最佳訓練條件的研究

大、小鼠穿梭箱實驗最佳訓練條件的研究

使用該框架可以定量描述實驗動物的自動回避反應和其他行為特征。這是評估皇家魚類學習和記憶能力最常用的行為測量工具。盡管利用穿梭箱來進行認知功能的相關研究已多有報道,如學習記憶、認知神經科學、神經生理學、神經藥理學,尤其是神經功能退行性病變等方面的研究,但就如何減少實驗的盲目性,有效利用穿梭箱并保證研究結果合理、可靠方面的研究卻鮮有報道。本文利用國內目前應用較廣的上海吉量軟件科技有限公司生產的一鼠通用型穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)(Shuttle-boxsystem),較為全面地考察了大小鼠的學習記憶形成及保持規(guī)律,旨在為今后類似研究提供借鑒和參考。1材料和方法1.1wirt-sd小鼠所有實驗動物均購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心,SPF級,生產許可證編號:scxk(軍)2007-0004。KM小鼠,4～6周,♂,(20±2)g;Wistar與SD大鼠6～8周,♂,(200±20)g。動物購入后,按照晝夜12h規(guī)律正常飼養(yǎng)于總后衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所動物實驗室(實驗動物使用許可證號:syxk2007-013),3d后進行正式實驗。1.2鼠通用型擊穿實驗視頻分析系統(tǒng)購自上海吉量軟件科技有限公司的一鼠通用型穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)(Shuttle-boxsystem,型號:JLBehv-SMG-1)。1.3條件刺激+逃避失敗實驗分為記憶獲得和記憶保持兩個階段。實驗開始時首先設定實驗參數(shù),包括安全期(非條件刺激與條件刺激之間的間隔時間)、條件刺激(高頻率的穩(wěn)定聲音刺激或者閃光燈強光刺激)時間、非條件刺激(電擊)時間及強度、穿梭次數(shù)等。在記憶獲得階段首先把實驗鼠放入左側室,接近并面向端壁,適應5min后開始訓練。穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)按照預先設定好的程序,先給一個可以察覺的條件刺激,持續(xù)一定時間后,如果實驗鼠仍停留在同側,則再給一個非條件刺激。動物受到電擊后將從圓洞逃至對側一定時間后,對側再給予條件和非條件刺激,如此反復。每只鼠連續(xù)訓練10d,每天穿梭幾十次。一次穿梭訓練結束后,間隔一定時間開始下一次訓練。經過反復訓練后,只給條件刺激,動物即逃到對側安全區(qū)以逃避電擊,此即形成了條件反射或稱主動回避反應。全部訓練結束后,計算機顯示出每次穿梭的軌跡,記錄大(小)鼠的主動回避反應(activeavoidanceresponse,AAR,即動物在條件刺激后,非條件刺激到來之前就產生的穿梭)次數(shù);被動回避反應(passiveavoidanceresponse,PAR,即實驗鼠在非條件刺激后才產生的穿梭)次數(shù);逃避失敗(escapefailure,EF,指實驗鼠在條件刺激和非條件刺激的過程中仍然停留在同側箱中)次數(shù)。以AAR作為其學習記憶成績的主要評價指標,并計算主動回避反應率(rateofAAR,ROA,即主動回避反應次數(shù)AAR占穿梭總數(shù)N的百分比),統(tǒng)計ROA>0.75(達標)的動物的百分比。1.4內存檢測實驗1.4.1gs組與s1s組KM鼠32只,隨機分為3組。SG5s組:11只,給予聲光刺激5s,安全期5s,交流電(0.3mA)擊5s;G5s組:10只,給予光刺激5s,安全期5s,交流電(0.3mA)擊5s;G10s組:11只,給予光刺激10s,安全期5s,交流電(0.3mA)擊5s。每組連續(xù)訓練10d,每天1次,每次穿梭30次。訓練成績用AAR表示。統(tǒng)計訓練10d中動物的達標(ROA>0.75)百分率,比較訓練d7兩組間動物AAR的差異。1.4.2多次多次擊穿,刺激條件實驗分2組,Wistar組:Wistar大鼠10只,給予聲光刺激10s,安全期30s,交流電(0.7mA)擊10s;SD組:SD大鼠10只,刺激條件同Wistar組。每組連續(xù)訓練10d,每天1次,每次穿梭20次。統(tǒng)計評估指標同“1.4.1”。1.4.3聲光刺激訓練Wistar大鼠19只,隨機分為2組。W-day:10只,白天訓練;W-night:9只,夜晚訓練。兩組均給予聲光刺激10s,安全期30s,交流電(0.7mA)擊10s。每組連續(xù)訓練10d,每天1次,每次穿梭20次。統(tǒng)計評估的指標同“1.4.1”。1.5內存保存實驗1.5.1小鼠記憶成績KM小鼠70只,按照“1.4.1”中G10s組的實驗條件連續(xù)訓練14d,每天1次,每次穿梭30次。選取ROA>0.75的小鼠36只,用同樣的訓練方法再連續(xù)訓練3d。取其AAR的均值作為小鼠記憶獲得成績(0day)。然后隨機分為6組,每組6只,分別用于考察間隔2、4、6、11、14、21d后記憶保持情況,以AAR作為記憶保持成績評估指標。1.5.2大鼠記憶分組Wistar大鼠40只,按照“1.4.2”中的實驗條件連續(xù)訓練14d,每天1次,每次穿梭20次。選取ROA>0.75的大鼠30只。用同樣的訓練方法再連續(xù)訓練3d。取其AAR均值作為大鼠記憶獲得成績(0day)。然后隨機分為6組,每組5只。分別用于考察間隔1、3、5、8、18、28d后的記憶保持情況,以AAR作為記憶保持成績評估指標。1.6統(tǒng)計分析所有實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組內顯著性檢驗用t檢驗;組間顯著性檢驗用ANOVA。2結果2.1聲光刺激4s組主動回避反應次數(shù)aar比較不同條件刺激對KM鼠記憶獲得的影響見Fig1,由圖可見,光刺激5s、10s組與聲光刺激5s組比較,主動回避反應次數(shù)AAR差異具有顯著性,前者的訓練成績好于后者;條件刺激時長對于KM鼠記憶獲得的影響見Fig1,由Fig1可見,光刺激10s組與光刺激5s組比較,AAR差異具有顯著性,前者的訓練成績好于后者。2.2兩組主動回避反應次數(shù)aar比較訓練時辰對于大鼠記憶獲得的影響見Fig2,由圖可見:Wistar大鼠白天訓練組與夜晚訓練組二者間主動回避反應次數(shù)AAR差異沒有統(tǒng)計學意義;不同鼠種對于大鼠記憶獲得的影響見Fig3,由Fig3可見:Wistar大鼠與SD大鼠相比,AAR差異有顯著性,Wistar大鼠的訓練成績好于SD大鼠。2.3g4,5KM小鼠與Wistar大鼠的記憶保持實驗結果分別見Fig4,5。由圖可見:無論是訓練達標的KM小鼠,還是訓練達標的Wistar大鼠,間隔一定時間后,其主動回避反應次數(shù)與訓練達標時相比較,差異均無顯著性,P>0.05。3實驗條件設置對學習記憶的影響主動回避行為條件反射是目前廣泛采用的動物行為學研究模式之一。大小鼠穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)屬經典的聯(lián)合型學習條件反射模式,是定量測定動物行為學改變的重要手段,其基本原理是動物通過學習能逃避有害的刺激。訓練期間達標動物分布百分比見Tab1,由Tab1可見,隨著時間推移,各組動物的訓練成績均在提高,達標動物數(shù)均在增加。除SG5s組與SD組外,其它組的成績在訓練d7時趨于穩(wěn)定,此后差異逐漸減小。KM鼠達標率為0.3～0.5;Wistar大鼠達標率為0.7～0.8。同時,研究中本課題組也注意到動物記憶獲得存在個體差異的現(xiàn)象,個別動物的成績與群體存在較大差異,較難或者根本就達不到訓練標準。KM小鼠學習記憶的獲得與穿梭箱的實驗環(huán)境設置有一定的相關性。本研究通過比較聲光與燈光條件刺激對KM鼠記憶獲得的影響發(fā)現(xiàn):單純的燈光刺激較聲光聯(lián)合刺激的效果好,更易使其形成條件反射,兩組學習成績相比差異具有統(tǒng)計學意義;同樣的燈光刺激,刺激時間的長短對其學習成績影響的差異也具有顯著性。因此,KM鼠的訓練成績與條件刺激的種類及時長有關,采用燈光作為條件刺激,并適當延長刺激時間有利于KM鼠條件反射的形成。本研究在考察實驗條件對于KM鼠學習記憶影響的基礎上,又考察了大鼠不同鼠種對學習記憶形成的差異。結果表明:對于同樣的實驗條件設置,兩組的學習成績相比差異具有顯著性,Wistar大鼠較SD大鼠更易形成條件反射;考慮到鼠類晝伏夜行的生活習性,本研究又考察了訓練時辰對于Wistar大鼠學習記憶的影響,結果表明:白天訓練組與夜晚訓練組的學習成績比較,差異沒有統(tǒng)計學意義,訓練時辰對于Wistar大鼠的記憶獲得沒有影響。對于記憶保持,本研究只考察了KM小鼠及Wistar大鼠訓練達標(ROA>0.75)后間隔不同天數(shù)的記憶保持情況。在考察的時間間隔內,其學習與記憶成績相比差異沒有統(tǒng)計學意義,說明其記憶在獲得后,相對穩(wěn)定且能夠保持較長