木霉株對金黃色殼囊孢菌的抑菌活性及其機(jī)制

木霉株對金黃色殼囊孢菌的抑菌活性及其機(jī)制

隨著柳樹種植面積的擴(kuò)大和管理的忽視，由黃河（cytolorachysta）引起的柳樹腐敗程度呈上升趨勢（cyborma）。重災(zāi)區(qū)常有林木成片死亡的現(xiàn)象,嚴(yán)重制約了林木工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展(曾大鵬,2002)。目前,對楊樹爛皮病防治工作除了加強(qiáng)栽培管理、適地適樹外,及時清除病原菌、控制病原菌種群數(shù)量也是防治工作的重點。傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑在抑制病原菌的同時,也殺死了樹體有益的微生物,影響生物多樣性系統(tǒng)的完整性,使病原菌產(chǎn)生抗藥性,污染環(huán)境(高克祥等,2001)。探索高效、安全的防治措施是目前亟需解決的難題。研究發(fā)現(xiàn):微生物發(fā)酵液提取物對楊樹爛皮病菌具有抑制作用,向玉英(1986)證明Psuedomonasfluorcells、Bacillussubtilis、B.punilus對楊樹爛皮病菌(C.chrysosperma)有顯著拮抗作用,Trichodermaviride等木霉菌對楊樹爛皮病菌的拮抗效果也較好。徐明等(2009)通過測定不同殺菌劑對楊樹爛皮病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用,篩選出了抑制楊樹爛皮病菌的有效殺菌劑。孫冬梅等(2006)研究了黃綠木霉菌(Trichodermaaureoviride)代謝產(chǎn)物對楊樹爛皮病菌的抑菌能力,認(rèn)為50%的黃綠木霉菌代謝產(chǎn)物在121℃處理25min抑菌作用可達(dá)100%。而有關(guān)這類抑菌物質(zhì)的抑制機(jī)制目前還不清楚。木霉菌(Trichoderma)作為自然界中資源豐富的拮抗微生物,因其抗菌譜廣、適應(yīng)性強(qiáng)等特點而被廣泛應(yīng)用。木霉菌競爭作用強(qiáng),能迅速生長進(jìn)行營養(yǎng)和空間位點的競爭;能產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抑菌物質(zhì),如木霉素、膠霉素、綠色木霉素和抗菌肽等。Dennis等(1971)報道木霉產(chǎn)生的一種揮發(fā)性乙醛對病原真菌具有抗性。Horace等(1986)研究表明:哈茨木霉防治立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的主要機(jī)制之一是產(chǎn)生一種揮發(fā)性的抗生素,經(jīng)鑒定為六戊烷基吡喃及戊烯基吡喃。Brukner等(1993)從長枝木霉及綠色木霉中分離提純出一組特殊的抗菌肽,分別命名為長枝木霉素(trichobrachin)和綠木霉素(trichovirin),并測定了氨基酸序列。孫彩云等(2002)證實了木霉菌株SMF2的固體發(fā)酵液中存在抗生素,對防治姜瘟青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)取得了很好的效果。木霉菌產(chǎn)生的這些抗菌類物質(zhì),對生態(tài)環(huán)境破壞性小,在生物農(nóng)藥開發(fā)和生物防治中受到越來越多的重視(陳凱等,2007)。本研究從國內(nèi)外29個木霉菌株中篩選出對楊樹爛皮病菌具有高效抑制作用的菌株,并提取抑菌活性物質(zhì)(Parketal.,2005)。通過提取物對病原菌的抑制研究,從病原菌代謝途徑的角度闡述了提取物的抑菌機(jī)制。上述結(jié)果將為抑菌活性物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的闡述和微生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌株和病原菌株試驗所用木霉菌株29株(表1),其中,引進(jìn)國外菌株7株、國內(nèi)菌株22株。病原菌株為楊樹爛皮病菌。菌株均保藏于東北林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室。試驗培養(yǎng)基為PDA和PD培養(yǎng)基。1.2測試方法1.2.1木霉菌生長特性的測定通過木霉菌株及培養(yǎng)液對病原菌的抑制效果進(jìn)行菌株篩選。1)木霉菌株對病原菌的拮抗作用采用對峙培養(yǎng)法。在直徑90mm的PDA平板培養(yǎng)基上,相距30mm先接入直徑6mm的病原菌菌餅,培養(yǎng)48h后,在同一平板上接種直徑6mm的木霉菌餅,以PDA平板培養(yǎng)基中心接種直徑6mm的木霉菌餅和病原菌菌餅作為對照,每處理3個重復(fù)。于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每12h觀測菌落縱橫半徑。采用2菌落相向半徑進(jìn)行拮抗效果測定(Songetal.,2004)。通過下列公式計算抑制效果:被抑制率=(單獨培養(yǎng)菌落半徑-菌落趨向半徑)/單獨培養(yǎng)菌落半徑×100%;相對抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率。2)木霉菌培養(yǎng)液對病原菌的抑菌作用采用生長速率法。取活化好的木霉菌餅3片,接入裝有300mLPD培養(yǎng)基的三角瓶(500mL)中,160r·min1.2.2抑菌活性檢測提取物的制備高效菌株抑菌活性成分的提取采用水提和酯提2種方式。1)抑菌活性成分的提取木霉菌株培養(yǎng)液的制備:用直徑1cm的無菌打孔器切取PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天的木霉菌餅,接種到300mLPD培養(yǎng)基的三角瓶(500mL)中,每瓶接種菌餅3片,于26℃、160r·min水提樣品的制備:方法參照冀瑞卿(2007)。酯提樣品的制備:選用石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、正丁醇6種有機(jī)溶劑作為萃取劑,以3∶1(V/V)比例常溫浸泡木霉菌株培養(yǎng)液48h,有機(jī)溶劑部分減壓濃縮,以10%吐溫80定容至25mL。2)抑菌活性檢測提取物對病原菌菌絲體生長影響的檢測采用生長速率法,對病原菌孢子萌發(fā)影響的檢測采用改進(jìn)的懸滴法(冀瑞卿,2007)。改進(jìn)的懸滴法:將樣品液與病原菌孢子懸浮液各取200μL加入到1.5mL離心管中,置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定時觀察是否有菌絲團(tuán)的出現(xiàn),每處理5個重復(fù)。以10%吐溫80作為對照。1.2.3抗氧化酶活性測定抑菌機(jī)制的研究主要從提取物對病原菌生理指標(biāo)和代謝酶系統(tǒng)的影響2個方面進(jìn)行。提取物能夠抑制病原菌菌絲體的生長,必然是破壞了菌絲體正常的生理代謝途徑,因此,應(yīng)選擇代謝途徑中關(guān)鍵酶的變化來研究木霉菌株對金黃殼囊孢菌的抑制機(jī)制;病原菌生理指標(biāo)則選擇電導(dǎo)率、丙二醛含量和蛋白質(zhì)含量。將PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天產(chǎn)生直徑約為2cm的病原菌菌絲團(tuán)洗凈后置于20mL含10%提取物的無菌水中,靜置。分別于2,4,6,8,10,12,24,48h后測定各項生理指標(biāo)和代謝酶活性指標(biāo),以10%吐溫80處理為空白對照(Baietal.,2003)。電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀直接測定(馬忠華等,1997)。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定(張志良等,2003)。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定(楊武英等,2005)。提取物對保護(hù)酶系統(tǒng)中SOD,CAT,POD活性的測定參照蔣繼宏等(2005)方法;對PPO和輔酶I含量的測定,對糖酵解途徑中HK,PK和LDH活性的測定,對TCA循環(huán)中SDH與MDH活性的測定,對ATP活性的測定,采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒(計紅芳,2007;王曉容等,2003)。2結(jié)果與分析2.1生長抑制率較高的菌株t-14、t-19t-19從對峙培養(yǎng)60h的試驗結(jié)果可以看出:相對抑制效果較高的菌株有T-33(圖1)、T-14和T-09,分別為39.9,21.5和20.6;生長抑制率較高的菌株有T-33,T-14和T-15,分別為85.1%(圖2),83%和69.6%(表1)。為此,將菌株T-33,T-14和T-09作為高效菌株進(jìn)行下一步篩選。2.2病原菌芽孢前抑制活性3個高效菌株的不同有機(jī)溶劑提取物對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制效果見表2。菌株T-33正丁醇提取物對病原菌菌絲生長的抑制率最高,為94%;其次為菌株T-14乙酸乙酯提取物,抑制率為78%。T-33,T-14和T-09菌株的正丁醇提取物和T-14菌株的乙酸乙酯提取物對病原菌孢子萌發(fā)抑制效果顯著。依據(jù)上述試驗結(jié)果,選擇T-33菌株的正丁醇提取物進(jìn)行下一步研究。2.3通過對t-33株正丁醇提取物的抗菌機(jī)制2.3.1織物處理前后病原菌電導(dǎo)率、丙二醛含量和蛋白質(zhì)含量的變化經(jīng)T-33正丁醇提取物處理后,病原菌菌體的電導(dǎo)率顯著提高(圖3)。從1h開始,經(jīng)提取物處理的菌絲體電導(dǎo)率的上升速度顯著高于對照組,說明提取物對菌絲體細(xì)胞膜起到了顯著的破壞作用。12h二者電導(dǎo)率差異達(dá)到最高,處理組高出對照組100.4%。24h后處理組的電導(dǎo)率趨于平穩(wěn),對照組則緩慢上升,處理組的電導(dǎo)率始終高于對照組。經(jīng)提取物處理后,病原菌菌絲體的丙二醛含量顯著提高(圖4a)。從2h開始提取物處理組的丙二醛含量上升速度顯著高于對照組,說明菌絲體膜脂過氧化嚴(yán)重。8h二者丙二醛含量均達(dá)到最高值,處理組高出對照組18.28%。24h后處理組和對照組的丙二醛含量差值趨于恒定,處理組始終高于對照組。提取物處理組的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(圖4b),對照組蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先升后降的緩慢變化。處理組蛋白質(zhì)含量明顯下降,說明提取物抑制了菌絲體蛋白質(zhì)的合成或者導(dǎo)致菌絲體的蛋白質(zhì)變性。2.3.2糖酵母酸激酶活性1)對SOD,CAT,POD和PPO活性的影響從圖5可以看出:SOD,CAT,POD和PPO4種酶對提取物均比較敏感,都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,這與蔣繼宏等(2005)報道的相一致。這種變化趨勢表明:菌體在提取物的逆境脅迫下,前期SOD,CAT,POD和PPO互相協(xié)調(diào)一致,呈現(xiàn)上升趨勢,以發(fā)揮它們對菌體的保護(hù)作用,后期由于氧自由基的增加和膜脂過氧化的加重,細(xì)胞透性增加,蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重,最終導(dǎo)致各種酶含量的降低或消失。2)對己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活性的影響己糖激酶(HK)是一種調(diào)節(jié)酶,具有調(diào)節(jié)糖酵解途徑的作用,催化葡萄糖形成6-P-葡萄糖。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途徑中的一個重要變構(gòu)調(diào)節(jié)酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸岵a(chǎn)生1個ATP分子。試驗結(jié)果顯示:對照組HK與PK酶活性隨時間的增長而持續(xù)上升,提取物處理組HK與PK酶活性隨處理時間的增長始終呈下降趨勢(圖6a,b)。從4h開始對照組和處理組呈現(xiàn)出顯著差異,24h處理組HK與PK酶活性分別低于對照84.8%和94.9%,48h處理組HK與PK酶活性分別低于對照組91.6%和99.2%。3)對乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響4)對SDH與MDH活性的影響TCA循環(huán)是生物細(xì)胞中十分重要的有氧分解代謝途徑,它不僅供給生物體能量,而且還是糖、脂、蛋白質(zhì)3大物質(zhì)轉(zhuǎn)化的樞紐。琥珀酸脫氫酶SDH與蘋果酸脫氫酶MDH是三羧酸循環(huán)中2個重要的氧化還原酶,這2種酶是細(xì)胞生長代謝和繁殖所必需的,它們直接影響整個TCA循環(huán)能否順利地運轉(zhuǎn)。試驗結(jié)果顯示:對照組病原菌菌絲體細(xì)胞的SDH與MDH酶活隨時間的延長而呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢,而處理組SDH與MDH酶活隨處理時間的延長下降速度越來越快,處理12h其活性幾乎接近于零(圖6d和圖7),說明病原菌菌絲體細(xì)胞的SDH與MDH的酶活受到了提取物的抑制和破壞,導(dǎo)致整個TCA循環(huán)的停滯。5)對輔酶Ⅰ活性的影響輔酶Ⅰ是多種脫氫酶的輔酶,參與機(jī)體中許多生物氧化過程,它的含量可以反映出細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。從圖8可知:對照組輔酶Ⅰ含量在試驗時間內(nèi)呈上升趨勢,表明菌體代謝基本正常;提取物處理組輔酶Ⅰ含量呈現(xiàn)下降趨勢,12h時幾乎接近零,與對照相比差異顯著。表明處理組的菌體中,以NAD為輔酶的脫氫酶,氧化還原反應(yīng)不能正常進(jìn)行,菌體代謝勢必出現(xiàn)紊亂。6)對ATP酶活性的影響ATP酶是一種轉(zhuǎn)運細(xì)胞膜內(nèi)外多種離子的酶,在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換,以及信息傳遞方面具有重要作用,生物體在逆境狀態(tài)下,該酶活性會發(fā)生明顯的改變。由圖9可知:對照組Na3保護(hù)酶系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)變化從29個木霉菌株中篩選出對楊樹爛皮病菌具有高效抑制效果的菌株T-33,該菌株培養(yǎng)液的正丁醇提取物對楊樹爛皮病病原菌菌絲體生長的抑菌率最高,為94%,并能夠抑制孢子萌發(fā)。該提取物可顯著提高病原菌菌絲體的電導(dǎo)率和MDA含量,降低病原菌蛋白質(zhì)含量,降低病原菌菌體的SDH,PK,HK,LDH,MDH與輔酶Ⅰ的活性,使Na馬忠華等(1997)曾報道:菌絲體內(nèi)MDA含量大幅度升高和麥角甾醇含量的降低,表明膜脂過氧化嚴(yán)重。左斌等(2005)報道:植物激活蛋白打破了保護(hù)酶系統(tǒng)原有的動態(tài)平衡狀態(tài),導(dǎo)致生物體代謝紊亂,植物細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶失活,最終導(dǎo)致死亡。冀瑞卿等(2007)研究了毒蘑菇活性成分對楊樹爛皮病的影響,測定了病原菌體內(nèi)自身保護(hù)相關(guān)酶系的變化。朱天輝等(1994)研究哈茨木霉菌(T.harzianum)對立枯絲核菌的抗生現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn),FO60菌株產(chǎn)生的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能抑制立枯絲核菌的生長和菌絲干物質(zhì)的積累,這些代謝物可以破壞病原真菌菌絲的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲,引起立枯絲核菌菌絲原生質(zhì)凝聚、菌絲斷裂解體。這些相關(guān)酶的變化與本試驗的結(jié)果基本是一致的,這說明病原菌體受到外界干擾后,通過信號傳輸導(dǎo)致自身酶系發(fā)生趨向本能的自我保護(hù),外界干擾導(dǎo)致的自身保護(hù)酶系統(tǒng)的改變基本上是一致的。本文研究了木霉提取物對楊樹爛皮病菌的抑菌作用,通過代謝過程中幾種酶的變化探討了提取物抑菌活性成分的抑菌機(jī)制。木霉菌株抑菌活性成