油松同工酶系統(tǒng)的電泳和染色研究

油松同工酶系統(tǒng)的電泳和染色研究

同工酶分析法是研究動植物遺傳變化的有效工具。1材料和方法1.1藥品與試劑.植物材料為油松6個天然和人工群體的1500粒種子,在室溫下浸種24h,在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至胚長出約7mm,剝?nèi)シN皮,分別取胚和胚乳待用.藥品中NADP,NAD,PMS,MTT,NBT,6-磷酸葡萄糖脫氫酶,固黑K鹽,莽草酸,d亮氨酰-β萘氨-鹽酸,d萘酸磷酯均為美國Sigma公司產(chǎn)品.馬鈴薯淀粉(浙江菱湖淀粉廠,北京化學(xué)試劑公司),水解淀粉(四川省彭州市軍樂化工廠)等為國內(nèi)藥品.電泳設(shè)備由北京六一廠生產(chǎn).1.2電泳系統(tǒng)的確定采用水平淀粉凝膠電泳方法,分析凝膠濃度、電泳緩沖系統(tǒng)、染色系統(tǒng)及酶提取液對多種酶系統(tǒng)的影響,為適宜的酶位點(diǎn)找出最佳電泳組合.分析的酶系統(tǒng)有參考王曉茹等2結(jié)果與分析2.1s-hcl緩沖液及trs-glycine緩沖液緩沖液緩沖液緩沖液緩沖液緩沖液緩沖液緩沖液緩沖液緩沖液配制采用1#的B緩沖液和Tris-HCl(pH7.3)緩沖液以及Tris-glycine(pH8.3)2.2siga淀粉實(shí)驗(yàn)國內(nèi)外有關(guān)實(shí)驗(yàn),主要采用Sigma淀粉2.3電泳緩沖系統(tǒng)參考油松、花旗松等針葉樹以及其它在植物中已報道成功的電泳染色程序1#緩沖系統(tǒng):對2#緩沖系統(tǒng):在此系統(tǒng)下,電壓很低時(50V),電流就幾乎達(dá)滿量程(100mA),調(diào)低電壓,電泳時間延長至8h,致使酶譜擴(kuò)散嚴(yán)重.3#緩沖系統(tǒng):在染4#緩沖系統(tǒng):在電泳過程中易出現(xiàn)大小膠分離的情況,而且5#緩沖系統(tǒng):染6#緩沖系統(tǒng):同樣染5#緩沖系統(tǒng)下的各種酶,只有7#緩沖系統(tǒng):染8#緩沖系統(tǒng):染9#緩沖系統(tǒng)王中仁根據(jù)對上述9種緩沖系統(tǒng)的試驗(yàn),從電泳緩沖系統(tǒng)所能支持的酶系統(tǒng)的有效性和廣譜性出發(fā),最后確定用1#緩沖系統(tǒng)染上述9種酶系統(tǒng)在該實(shí)驗(yàn)條件下可做為穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記,用于油松遺傳多樣性和交配系統(tǒng)等方面的分析.2.4胚和胚乳染色等位基因根據(jù)在1#和9#緩沖系統(tǒng)條件下電泳,按表2的方法對9種同工酶染色,所得譜帶見圖1,共獲得15個酶系統(tǒng),56個等位基因.:著色深,譜帶寬,共出現(xiàn)3個位點(diǎn),:出現(xiàn)2個染色區(qū),胚和胚乳染色都很清晰,在濃度和寬度上,:1個染色區(qū),胚和胚乳染色都很清晰,包含5個等位基因,有1個為啞等位基因.:2個染色區(qū),各位點(diǎn)都是胚乳染色深而胚淺,均有3個等位基因.:2個染色區(qū),胚、胚乳譜帶深分離清晰,:位于陽極的染色區(qū)比較穩(wěn)定,胚和胚乳都染色深,出現(xiàn)5個等位基因.位于陰極附近的染色區(qū)時有時無,故未做分析.:有2個染色區(qū),:只有1個染色區(qū),胚和胚乳染色都很淺,出現(xiàn)3個等位基因.:只在點(diǎn)樣孔附近出現(xiàn)1條負(fù)帶,擴(kuò)散嚴(yán)重,有2個等位基因.3電泳緩沖系統(tǒng)的篩選同工酶分析易受內(nèi)外環(huán)境影響,不同發(fā)育時期或不同組織的同工酶會表現(xiàn)不同,實(shí)驗(yàn)條件中,電壓高低、電流大小、電極和凝膠緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度以及凝膠濃度等都會使同工酶呈現(xiàn)不同的譜帶,因此在篩選酶系統(tǒng)時就要注意保持材料及實(shí)驗(yàn)條件一致.有些酶應(yīng)用同樣的染色方法在不同的電泳緩沖系統(tǒng)中除遷移率有所差異外,酶譜表現(xiàn)基本一致,如相同的酶系統(tǒng)在相同的提取緩沖液及電泳緩沖系統(tǒng)下因染色方法的不同可能表現(xiàn)不同.MDH在Tris-glycine(pH8.7)就具體物種的某同工酶系統(tǒng)來說,盡管可以通過大量實(shí)驗(yàn)比較,