大腸菌群檢測知識(shí)及MPN法檢測的注意要點(diǎn)

大腸菌群檢測知識(shí)及MPN法檢測的注意要點(diǎn)一、大腸菌群的定義：1、指一群在36℃條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。2、該菌群主要來源于人畜糞便,作為糞便污染指標(biāo)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生狀況,推斷食品中腸道致病菌污染的可能。3、大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名，而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌。這群細(xì)菌包括：大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌。4、生化特征及血清學(xué)反應(yīng)并非完全一致。5、典型大腸桿菌的IMVIC與硫化氫試驗(yàn)結(jié)果：++---。二、分布：1、廣泛分布于自然環(huán)境。2、來源于人和溫血?jiǎng)游锏募S便。三、衛(wèi)生學(xué)意義：1、大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評(píng)價(jià)樣品中是否受到糞便的污染。2、大腸菌群計(jì)數(shù)的高低，直接反映了樣品受糞便污染的程度。3、表示對(duì)人體健康是否具有潛在的危險(xiǎn)性。大腸菌群是理想的糞便污染的指標(biāo)菌4、是人類和溫血?jiǎng)游锬c道菌群，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。5、隨糞便排出體外后，在外界環(huán)境影響下，其存活時(shí)間應(yīng)與腸道致病菌大致相似或稍長。6、檢驗(yàn)方法簡便，易于檢出與計(jì)數(shù)。7、對(duì)消毒劑的抵抗力應(yīng)不低于腸道致病菌。四、大腸菌群在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)：1、大場菌群在LST培養(yǎng)基里陽性結(jié)果2、大場菌群在BGLB培養(yǎng)基里陽性結(jié)果3、大場菌群在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂VRBA上的菌落特征4、大場菌群在去氧膽酸鈉鹽瓊脂上的菌落特征5、大場菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂上的菌落特征6、大場菌群在顯色培養(yǎng)基上的菌落特征五、大腸菌群檢驗(yàn)MPN法接種量剖析：接種量問題，GB4789.3-2016中7.2初發(fā)酵試驗(yàn)規(guī)定“選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1mL（如超過1mL，則用雙料LST）”。這里所說的接種量1mL并非1mL樣品接種量（即MPN檢索表中的1mL樣品接種量），而是接種的稀釋液的體積V=1mL（為了區(qū)分，本文中用V表示），那么實(shí)際的接種量m（為了區(qū)分，本文中用m來表示）為m×p（p為稀釋液濃度）。那么括號(hào)中的接種量超過1mL就是要V＞1mL，而MPN檢索表中的實(shí)際接種量都為10-n系列數(shù)，所以V也只可能是10mL（100mL在實(shí)際中不可能），也就是說接種體積V=1mL，用單料，V=10mL用雙料。例如：25g樣品＋225mL緩沖液—1：10稀釋液1：10稀釋液+9mL緩沖液—1：100稀釋液若：1：10稀釋液接種10mL至雙料LST，接種量為：10mL×0.1g/mL=1g1：10稀釋液接種1mL至單料LST，接種量為：1mL×0.1g/mL=0.1g1：100稀釋液接種1mL至單料LST，接種量為：1mL×0.1g/mL=0.01g培養(yǎng)基裝量在GB4789.3-2016中沒有作任何說明，所以各人的理解更是不一，可能有的人單雙料都用10mL，有的人用9mL，有的更多或更少。那么到底培養(yǎng)基裝量有沒有什么規(guī)則，是不是怎樣都行？其實(shí)不是，GB/T5750.12—2006中總大腸菌群檢測方法中2.1.5.1.1中使用的是單料雙料都是10mL，這實(shí)際上是為了使得接種稀釋液后所有的發(fā)酵管培養(yǎng)基濃度達(dá)到培養(yǎng)基本身的使用濃度。雙料10mL，再接種10mL稀釋液后濃度降低一倍就還原了培養(yǎng)基本身的使用濃度，而單料它本身就是培養(yǎng)基的使用濃度，那么接種1mL稀釋液后為了使培養(yǎng)基的濃度不至降低太多，就要讓培養(yǎng)基裝量盡可能的多，但是試管的裝量也是有限度的，所以選擇裝量在10mL左右比較合適。五、大腸菌群檢驗(yàn)MPN法注意事項(xiàng)及要點(diǎn)：1、MPN法注意事項(xiàng)：?全過程不得超過15min。?樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，?（如接種量需要超過1mL，則用雙料LST肉湯）?以48h±2h為最終觀察結(jié)果時(shí)限。結(jié)果也以此時(shí)為最終結(jié)果。2、MPN法培養(yǎng)基：LST、BGLB：（1）月桂基磺酸鹽胰蛋白胨（LST）月桂基磺酸鈉能抑制革蘭氏陽性菌的生長，同時(shí)比膽鹽的選擇性和穩(wěn)定性好。由于膽鹽與酸產(chǎn)生沉淀，沉淀有時(shí)候會(huì)使對(duì)產(chǎn)氣情況的觀察變得有些困難；?乳糖是大腸菌群可利用發(fā)酵的糖類。有利于大腸菌群的生長繁殖并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌；?胰蛋白胨提供基本的營養(yǎng)成分；?LST肉湯是國際上通用的培養(yǎng)基，與乳糖膽鹽肉湯的作用和意義相同，但具有更多的優(yōu)越性。?發(fā)酵試驗(yàn)判定原則：產(chǎn)氣為陽性。?檢測步驟減少（不必分離培養(yǎng)），檢測時(shí)間縮短24h。?注：如接種量超過1mL，則應(yīng)用雙料LST肉湯（2）煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌。?煌綠是抑菌抗腐劑，可增強(qiáng)對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制作用。?乳糖是大腸菌群可利用發(fā)酵的糖類。有利于大腸菌群的生長繁殖并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌。?發(fā)酵試驗(yàn)判定原則：產(chǎn)氣為陽性。由于配方里有膽鹽，膽鹽遇到大腸菌群分解。?乳糖所產(chǎn)生的酸形成膽酸沉淀，培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色，同時(shí)可看到管底通常有沉淀。3、MPN檢索表的應(yīng)用：MPN（最可能數(shù)mostprobablenumber）是表示樣品中活菌密度的估測。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不是樣品中活菌數(shù)的真值。4、使用MPN檢索表的注意點(diǎn)：?這個(gè)MPN檢索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北歐等標(biāo)準(zhǔn)通用的。?表里的數(shù)字是有小數(shù)點(diǎn)的。?報(bào)告單位不同?，F(xiàn)報(bào)告單位為g/ml，而原報(bào)告單位是100g/ml。?原標(biāo)準(zhǔn)MPN表有64個(gè)組合，而現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)MPN表只有40個(gè)組合。當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MPN表中無