實驗報告 蛋白質(zhì)分子的測定

PAGEPAGE1實驗一蛋白質(zhì)分子的測定─凝膠層析法實驗原理凝膠層析法（即凝膠過濾法，gelfiltration）是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法。將凝膠顆粒在適宜溶劑中浸泡，使充分吸液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物，再以同一溶劑洗脫，在洗脫過程中大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，流蘇緩慢，一直最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得以分離。凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然凝膠還是人工合成凝膠，其內(nèi)部都具有很微細(xì)的多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠層析法常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠（Sepharose），人工合成的凝膠是聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel-P）和葡聚糖凝膠（SephadexG）。其中葡聚糖凝膠是具有不同孔隙度的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，不溶于水。將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt表示。Vt由Vo，Vi與Vg三部分組成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo為“孔隙體積”、“外水體積”，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積；Vi為內(nèi)體積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積；Vg為凝膠本身體積；Ve為洗脫體積，即自加入樣品時算起到組分最大濃度（峰）出現(xiàn)時所流出的體積，Ve與Vo及Vi之間的關(guān)系為：Ve=Vo+KdVi，；Kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，Kd=(Ve-Vo)/Vi，有效分配系數(shù)為Kav，Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)。在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當(dāng)流動相流過Vt體積后，所有的組分都應(yīng)該被洗出來，這一點為凝膠層析的特點，與一般層析方法不同。Ve與分子量的關(guān)系：對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān)，流過凝膠柱時，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關(guān)系為：Ve=K1-K2logM，K1與K2為常數(shù)，M為分子量，通常用Kav代替Ve，建立標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子式量LgM與Kav的標(biāo)準(zhǔn)曲線，稱為“選擇曲線”。在允許的工作范圍內(nèi)，曲線越陡，則分級越好，而工作坊為越窄。凝佼層析主要決定于溶質(zhì)分子的大小，每一類型的化合物，如球蛋白類，右旋糖酐類等都有它自己的特殊的選擇曲線，可用以測定未知物的Mr，測定時以使用曲線的直線部分為宜。試劑材料[試劑]1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：藍(lán)色葡聚糖（分子式量200000），牛血清蛋白（分子式量67000），胃蛋白酶（分子式量36000），CytC(分子式量13700)。2、洗脫液：0.2mol/LTris-HCl-KCl，pH7.53、SephadexG-75。[器材]1、層析柱：柱管1.0×40cm。2、紫外分光光度計。3、部分收集器。4、刻度試管。實驗步驟[1]凝膠裝柱：先將洗脫液緩慢導(dǎo)入柱管內(nèi)，然后將處理好的凝膠溶液加入層析管中。等到凝膠層膠面快接觸到管頂端時，將洗脫管接好，洗脫30分鐘，直到凝膠柱穩(wěn)定。[2]調(diào)試液滴速度：將洗脫液速度調(diào)節(jié)至每分鐘17滴，將時間定在3.0分鐘自動調(diào)換試管，為加樣收集洗脫液做準(zhǔn)備。[3]加樣：當(dāng)液滴速度穩(wěn)定在17滴每分鐘之后，將層析管打開，用膠頭滴管吸走多余的洗脫液。此時將藍(lán)色葡聚糖沿管壁加入凝膠層，同時用夾子夾住洗脫液出口，當(dāng)葡聚糖加完之后，松開夾子，記錄藍(lán)色葡聚糖達(dá)到層析管低端的時間，此時收集的洗脫液體積即為Vo，Vo=Ve=1\*ROMANI。此時用夾子夾住洗脫液出口，重復(fù)上述步驟，添加牛血清蛋白質(zhì)。按照上述方法將4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣本依次加入層析管中層析。需要注意的是，需記錄每次加樣的試管號，以便計算各種物質(zhì)的洗脫液體積，以后每加一種蛋白質(zhì)的時間都要比上一種蛋白質(zhì)添加時間間隔長；用分光光度計測定各試管洗脫液吸光度值，標(biāo)出各個峰值，第二次加樣到第二個峰值出現(xiàn)的各試管洗脫液的體積即為Ve=2\*ROMANII，第三次加樣到第三個峰值出現(xiàn)的各試管洗脫液的體積即為Ve=3\*ROMANIII,第四次加樣到第三個峰值出現(xiàn)的各試管洗脫液的體積即為Ve=4\*ROMANIV。[4]記錄上述試驗各部實驗數(shù)據(jù)，建立有效分配系數(shù)Kav和洗脫液Ve標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗結(jié)果實驗過程中，記錄實驗試管編號和每個試管的洗脫液體積，以及相對應(yīng)的吸光度值如下表所示：表1凝膠層析實驗原始數(shù)據(jù)試管編號單管洗脫液體積/ml洗脫液總體積/mlA280nm14.54.50.052237.50.0893310.50.0814313.50.0615316.50.2526319.50.1377322.50.0408325.50.0239328.50.02310331.50.01611334.50.18812337.50.13513340.50.07114343.50.04115346.50.03216349.50.02217352.50.02018355.50.02719358.50.04020361.50.10321364.50.03622367.50.01223370.50.01424373.50.01325376.50.01726379.50.01727382.50.023281.884.30.03629387.30.03530390.30.02331393.30.00732396.30.00733399.30.006343102.30.010353105.30.018363108.30.090373111.30.237383114.30.251393117.30.172403120.30.087413123.30.034423126.30.024利用Excel2003繪制洗脫液總體積—吸光值散點圖，見圖1。和實驗操作一樣，有4個峰值，分別為藍(lán)色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白和CytC。從中可知，V0=Ve=1\*ROMANI=16.5ml，Ve=2\*ROMANII=34.5ml，Ve=3\*ROMANIII=61.5ml，Ve=4\*ROMANIV=114.3ml。圖1凝膠層析洗脫液體積與對應(yīng)吸光度值散點圖建立標(biāo)準(zhǔn)蛋白Ve與與LogM標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2、圖1。相關(guān)系數(shù)R2=0.9267，相關(guān)性較好，可作為為測定未知蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此最終的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Ve=-84.062·LogM+452.21。表2各標(biāo)準(zhǔn)蛋白Ve與logM值蛋白質(zhì)種類葡聚糖牛血清胃蛋白CytCVe16.534.561.5114.3logM5.3014.8264.5564.137圖2蛋白質(zhì)Ve與LogM的線性圖分析與討論[1]在允許的工作范圍內(nèi)，曲線越抖，則分級越好，本實驗選擇曲線斜率為-84.062，曲線很陡，說明此蛋白質(zhì)的分級很好。[2]從洗脫液總體積—吸光值散點圖（圖1）看，除了4個標(biāo)準(zhǔn)品的峰外，在葡聚糖之前、胃蛋白和CytC之間均出現(xiàn)了很小的