小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)

小鼠胚胎干細胞分化為精于細胞的研究進展鄭晨光生科091學號090304109(河北科技大學生物科學與工程學院石家莊050018)摘要：胚胎干細胞(ESCs)是一種具有分化發(fā)育為三個胚層組織細胞潛能的全能性細胞，哺乳動物的精子起源于原始生殖細胞(PGCs),ESCs可分化為PGCs,并進一步分化為精子細胞。通過在培養(yǎng)基中添加誘導分化因子(如維甲酸等)或與希望誘導分化的目的細胞(如Sertoli細胞等)共培養(yǎng)，并通過鑒別ESCs分化為生殖細胞的各階段特異性基因標志物c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mill和mil2等，獲取不同階段的生殖細胞。鼠的ESCs已誘導出了不成熟的精子細胞，但到目前為止尚無成熟精子培養(yǎng)成功，且誘導分化的效率很低。關鍵字：小鼠；胚胎干細胞；精子胚胎干細胞是由哺乳動物早期胚胎分離克隆的一類未分化二倍體細胞，能在體外增殖，并能保持未分化狀態(tài)。在一定條件下可以分化為包括生殖細胞在內的三個胚層的所有細胞類型。目前，已從ESCs誘導出神經細胞、心肌細胞、肝細胞、骨細胞、胰島素分泌細胞等。小鼠胚胎干細胞體外已成功誘導分化為精子細胞和卵母細胞，人胚胎干細胞理論上也具備分化為生殖細胞的潛能。2003年5月Hubner等成功將鼠胚胎干細胞體外分化為生殖系統的卵母細胞，并在Science上報道了該成果。近來有實驗室從小鼠ESCs體外分化產生雄性原始生殖細胞，孵育分化后注入到卵母細胞可發(fā)育成囊胚，且檢驗為正常的二倍體核型。本文從小鼠胚胎干細胞定向分化為精子細胞的基因標記和方法學2個方面，對ESCs向精子細胞分化的最新研究進展作一綜述。1原始生殖細胞的發(fā)育雌、雄鼠合籠至母鼠見陰栓后(dayspost-coitum,dpc)7d，鼠胚胎中出現原始生殖細胞(primordiralgermcells,PGCs),經過增殖，移行到生殖嵴，并繼續(xù)分化為生殖干細胞(germstemcells,GSCs),這些細胞是精子和卵子發(fā)生的基礎。大部分研究者都認為，PGCs是生殖細胞最初的形式，小鼠胚胎在三個胚層形成時，PGCs同時出現。PGCs從性腺原條移行到尿囊再移行到近端內胚層中，dpc7d后在中胚層遠端可觀察到PGCs,dpc8d移行到尿囊再到原腸，這被稱為移行期PGCs,在dpc9.5-11.0d,移行至生殖嵴，這一階段被稱為移行后期PGCs,當PGCs分化為生殖母細胞時，睪丸或卵巢的結構就已經確立。對于雄性小鼠，生殖母細胞一直停留在有絲分裂期直到出生后2d,然后到達輸精管基底膜或者停留在管腔中退化，那些存活下來的細胞則繼續(xù)分化為GSCs,經過多細胞分化階段，分化為精母細胞，精母細胞減數分裂為精子細胞，后者最終分化為精子。也就是說，在雄性胚胎中生殖細胞要經歷移行前期PGCs、移行期PGCs、移行后PGCs、生殖母細胞、A型精原細胞、GSCs和減數分裂前生殖細胞，才形成成熟的精子。在這段復雜漫長的變化中，有多種不同的特異基因的表達。2生殖細胞分化的基因標記PGCs的很多標志物在未分化的ESCs上也有表達，擺在研究者面前的挑戰(zhàn)就是如何區(qū)分這2種細胞。且ESCs在分化為PGCs的過程中，各個階段的基因標記也不同。ESCs的分化依賴于特異基因表達，在生殖細胞分化中起關鍵作用的基因有c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mill和mil2等，這些基因的表達有階段特異性，即在生殖細胞的不同發(fā)育階段，它們分別穩(wěn)定地表達，從而成為原始生殖細胞分化過程中的特異性標志。2.1減數分裂前生殖細胞分化的基因標記減數分裂前的基因標記包括OCT4、NANOG、Stella、GDF3、PUM1、PUM2、NANOS1,其中NANOG和PUM1對果蠅和蠕蟲的生殖細胞的形成有重要作用。還有一些基因，如c-kit、VASA、DAZL從減數分裂前PGCs階段一直表達到生殖細胞分化完成，是分化中的關鍵基因。c-kit在PGCs的表達水平較高，在PGCs和造血細胞中，c-kit的表達活性和單個DNaseI的高敏感位點相關。c-kit原癌基因的2種產物在控制雄鼠的生育力方面發(fā)揮了雙重作用。c-kit的第1種產物是干細胞因子(stemcellfactor,SCF)的跨膜酪氨酸激酶受體，它表達于出生后睪丸組織中分化的精原細胞，并發(fā)揮其功能。第2種是一種胞內蛋白tr-kit,當通過選擇基因啟動子使精子發(fā)生時，它有明顯的聚集。當它被注射到鼠的II期卵中時，可以觸發(fā)卵的激活。在減數分裂的起始，c-kit停止表達，而tr-kit則在精子發(fā)生的減數分裂后期表達。干細胞因子/kit配子的跨膜受體由白斑基因編碼，它在PGCs的正常擴增、存活和移行中發(fā)揮重要作用。雌激素刺激Steel基因轉錄，增加kit配子的產物，最終促使PGCs的正常生長。在原腸胚后期，OCT4僅在PGCs上表達，且在其全能性上有重要作用。用基因打靶的技術可以證實，OCT4的缺失會引起PGCs的凋亡。OCT4在不同性別的生殖細胞中表達不同，雌性胎兒在出生后,OCT4在生殖腺中的表達迅速降低，在卵子進入第一次減數分裂時就不再表達，在雄性則一直表達到生殖母細胞的形成和嬰兒期的精原細胞中。DAZ(deletedinazoospermia,DAZ)基因家族的成員也可用來作為生殖細胞鑒定的標志，因為它們只在生殖細胞中表達。DAZ基因的同系物DAZL(DAZ-like,DAZL)的蛋白質產物在大部分雄性和雌性的生殖細胞中都表達，且對于PGCs的發(fā)育和PGCs來源的生殖細胞的成熟和分化都是必需的?；騠ragilis和Stella在生殖細胞的發(fā)育中起到了重要的作用,它們是PGCs和減數分裂前生殖細胞的特異基因，在生殖細胞的特化中發(fā)揮作用。fragilis是一種跨膜蛋白，也是一種干擾素誘導蛋白。它的表達在PGCs的移行期增加，它還有抗增殖作用，可用來延長PGCs中細胞周期的時間。fragilis和Stella在ESCs和胚胎生殖細胞(embryonicgermcells,EG)中亦有表達，說明它和上述細胞的全能性有關；Stella和染色體重組及RNA轉錄后加工相關。將綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)作為Stella基因的報告基因制成轉基因小鼠，可以精確地顯示PGCs的發(fā)育過程。2.2減數分裂和減數分裂后生殖細胞分化的基因標記減數分裂和減數分裂后階段特異的基因標記有VASA、聯會復合體1,3(SCP-1,3),TEKT1等，經過減數分裂后就可形成單倍體精子細胞°VASA從減數分裂前就開始表達，它一直表達到減數分裂后生殖細胞的形成。VASA是一種細胞質蛋白，它只在卵巢和睪丸中表達，是生殖細胞高度特異的標志。VASA同源基因Mvh的表達產物由生殖嵴的體細胞誘導產生°Mvh基因的變異將會導致PGCs分化和擴增的缺陷。Toyooka等將ESC分化后表達陽性Mvh的細胞植入小鼠的睪丸中，最后形成了具有精子形態(tài)學特征的細胞。SCP3的表達對于第一次減數分裂的啟動具有重要作用，是聯會復合體軸側成分的一部分，是檢測哺乳動物發(fā)生減數分裂轉變的高度特異性標志°TEKT在小鼠精母細胞和圓形精子細胞中可檢測到，隨著精子發(fā)生，TEKT1消失，在變長的精子尾側端檢測到TEKT1強陽性，推測TEKT1與中心體有關，可能參與成熟精子鞭毛軸絲的核化和基體組裝，因此TEKT1是精子細胞分化后期的特異標志。2.3其它分子標志物除了這些基因的表達，還有一些其它的標志物:非特異性堿性磷酸活性、階段特異性胚胎抗(stage-specficembryonicantigen,SSEA)、1和6抑制素及骨形態(tài)發(fā)生蛋白等。通過以上這些標志物，研究者可以從胚胎干細胞形成的擬胚體中分離出GSCs,并進一步分化為精子細胞。PGCs具有較高的AKP活性，但是現在還并不清楚該酶的活性對于這些細胞的生存是否必需。在PGCs分化為GSCs的過程中，AKP活性降低，c-kitSSEA-1的表達降低。在GSCs階段又有新的表面標志，如1和6抑制素，c-kit在分化為A型精原細胞時再次出現。BMP是轉化生長因子超家族的成員，它和PGCs的特化有協同效應。其胚外胚層分泌BMP-4和BMP-8b的功能最重要，它們單獨并不能誘導外胚層分化為PGCs,二者一起和受體復合物結合，可將信號傳遞給轉錄因子，進而導致目的基因的表達°BMP-4通過PGCs和卵原細胞上的Alk3和R-Smad受體影響這些細胞，所以將它添加到ESCs和GSCs培養(yǎng)體系中，將促使ESCs分化為生殖細胞［4］細胞分化是基因調控選擇性表達的結果，上述基因在ESCs、PGCs和GSCs階段的關閉和開放，初步觀察了精子細胞誘導過程中的基因表達，為進一步研究人類生殖細胞的發(fā)育提供了非常有價值的參考。3人類應用和展望2006年，Nagernia等已成功地從小鼠的ESCs中分化出不成熟的精子細胞。然后把這些細胞注射到小鼠的卵子中，結合后的胚胎被移植到雌鼠體內。最終分娩出小鼠并長成成年小鼠［6］。但是，目前在ESCs分化為精子細胞上的研究還僅停留在動物實驗階段°ESCs培養(yǎng)與分化的研究不但可以促進對人和動物生精機制的理解，還為生精功能阻滯的患者提供了一條解決生育難題的途徑，為眾多不孕不育患者帶來了新的希望。近40年來，國內外大量研究者在體外誘導生精細胞減數分裂以及減數分裂后分化上做了大量工作［27］，但由于對生精細胞發(fā)育分化微環(huán)境缺乏足夠的了解以及分離純化各級生精細胞存在困難等原因，到目前為止，成熟的生精細胞體外培養(yǎng)分化系統仍未建立。十余年來，ESCs研究成果巨大，名列十大科學進展首位，ESCs向精子細胞的定向分化對于充分理解精子細胞發(fā)育中的調控具有特別重要的意義，對解決上述問題也有借鑒之處。由于鼠和人的ESCs有種屬差異，影響鼠ES細胞分化為精子細胞的基因調控是否也會對人ESCs的分化產生影響？如何才能提高ESCs誘導為生殖細胞的效率？雄性配子和雌性配子在分化上的共性和差異在哪里？在體外將胚胎干細胞分化為精子細胞并進一步形成胚胎，對后代有無影響？通過對這些問題的研究，我們將會對生殖細胞的發(fā)育分化的分子潛能有更深的認識，從而促進核移植技術的發(fā)展并進一步發(fā)掘其潛在的治療價值。參考文獻蔡桂萱，韓嶸，尚克剛,.小鼠胚胎干細胞系的建立及其特性分析［J］.細胞生物學雜志，1996,18(3):126-26.黃冰,小鼠胚胎干細胞系的建立及其嵌合體小鼠的獲得［J］.細胞生物學雜志，2001,23(1):28-31.孟國良，湯富酬，等.小鼠胚胎干細胞(ES細胞)建系和維持過程中的問題及對策［J］.遺傳，2001,23(3):292-294.叢笑倩，姚鑫.小鼠胚胎干細胞(ES-8501)建系過程的核型及特性分析［J］.實驗生物學報，1987,20(2):237-241.董曉，馮書堂.小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)克隆分離傳代研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2002,33(5):431-438.招霞，孫海翔，胡婭莉，等.ICR小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)及飼養(yǎng)層的制作［J］.醫(yī)學研究生學報，2006