釀酒酵母總蛋白的提取及表達(dá)特性研究

釀酒酵母總蛋白的提取及表達(dá)特性研究

0工程技術(shù)應(yīng)用母乳喂養(yǎng)在遺傳和細(xì)胞生物學(xué)的研究中發(fā)揮著非常重要的作用，同時(shí)也是互補(bǔ)工程技術(shù)的重要組成部分。核酸藥物是以核酸為作用靶點(diǎn)的藥物,干擾或阻斷細(xì)菌、病毒和腫瘤細(xì)胞的核酸合成,有效地殺滅或抑制細(xì)菌、病毒和腫瘤細(xì)胞1材料方法1.1企業(yè)地震產(chǎn)品制度釀酒酵母S.cerevisiaeBY4741(MATα;his3△1;leu2△0;met15△0;ura3△0);抗性菌株BY47411.2雙酰甲基氨甲基pahs-3-甲基苯甲酰磺酸酯tki的合成YPD液體培養(yǎng)基(2%Tryptone,2%Glucose,1%Yeastextract);酵母完全合成(SC)固體培養(yǎng)基(0.17%YeastNitrogenBase,0.12%GlutamicAcid,0.2%Drop-outMix,1.5%Agar,2%Glucose);裂解緩沖液:8mol/L尿素,2mol/L硫脲,1%(w/v)二硫蘇糖醇(DTT),1mmol/L苯甲?；酋７?PMSF),1mmol/LNaF,35mmol/LTris,5mmol/LEDTA,DTT、PMSF、NaF臨用前再加;牛血清蛋白(BSA);蝸牛酶;濃HCl;牛血清白蛋白(BovineAlbumin,BSA)均為分析純;10%SDS;四甲基乙二胺原液(TEMED);30%丙稀酰胺;5×電泳液緩沖液;10%過(guò)硫酸胺(AP);1.0mol/LTris·HCl(pH6.8);磷酸鹽緩沖液;1.5mol/LTris·HCl(pH8.8);PageRuler1.3tnbio高壓細(xì)胞破碎高速離心機(jī),UV-2100紫外分光光度計(jì),超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),TNBIO高壓細(xì)胞破碎機(jī),Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng),玻璃珠(Sigma,0.3mm),渦旋振蕩儀,OLYMPUSBX53F相差顯微鏡,佳能EOS600D,垂直蛋白電泳儀。2測(cè)試方法2.1菌液光密度測(cè)定酵母細(xì)胞接種于50mLYPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),160r/min,30℃培養(yǎng)48h,在600nm處測(cè)定菌液的光密度(OpticalDensity,OD),使OD值達(dá)到OD2.2破碎離心液參照文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)參考李聰?shù)劝凑赵篮橄嫉葏⒖嘉墨I(xiàn)[14]的方法。向離心管中加入4mL裂解液緩沖液,振蕩混勻后,在功率0.75kW,壓力150~180MPa的條件下,經(jīng)25s一次性破碎,12000r/min離心10min,收集上清液。2.3化學(xué)方法參考賈艷萍等2.4破碎率檢測(cè)的計(jì)算采用活菌顯微鏡直接計(jì)數(shù)法:式中:α為酵母細(xì)胞的破碎率;A2.5蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)通過(guò)比色來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量2.6濃縮膠和分離膠對(duì)測(cè)定蛋白表達(dá)的影響采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳,5.0%濃縮膠(pH6.8)和10%分離膠(pH8.8),上樣量為每孔300μg蛋白。取一定體積實(shí)驗(yàn)樣品和Marker上樣,濃縮膠電壓為80V,分離膠電壓為120V。電泳結(jié)束后,進(jìn)行G-250染色。3結(jié)果與分析3.1不同破碎方法對(duì)細(xì)胞破碎率的影響采用相差顯微鏡(OLYMPUSBX53F)對(duì)破碎前后的酵母菌混懸液進(jìn)行細(xì)胞完整性觀察,如圖1所示。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)單位體積完整細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用活菌顯微鏡直接計(jì)數(shù)法算出不同處理細(xì)胞破碎率,評(píng)價(jià)不同方法處理酵母細(xì)胞裂解效率。不同破碎方法處理樣品細(xì)胞破碎率分別為:反復(fù)凍融法(44.59±4.49)%,超聲波破碎法(67.21±1.43)%,酸洗玻璃珠法(81.25±0.91)%,高壓破碎法(57.69±6.96)%,液氮研磨法(50.3±4.06)%,酶法(53±3.37)%?？芍?酸洗玻璃珠法對(duì)酵母的細(xì)胞破碎率(81.25±0.91)%,比其他5種方法效率都高,反復(fù)凍融法細(xì)胞破碎率(44.59±4.49)%,其效率最低,其他依次為超聲波破碎法>高壓破碎法>酶法>液氮研磨法。酸洗玻璃珠法操作簡(jiǎn)便,樣品間不會(huì)交叉污染,不需要高壓設(shè)備,期間低溫提取過(guò)程有利于蛋白充分溶解。采用高壓細(xì)胞破碎儀破碎酵母,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品損失較多。3.2反復(fù)凍融法與超聲波法比較建立蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),然后測(cè)定待測(cè)樣品溶液的A由圖2可知,在酵母細(xì)胞中,6種細(xì)胞破碎方法提取的總蛋白含量分別是液氮研磨法為68mg/mL,超聲波破碎法125.67mg/mL,酸洗玻璃珠法152.67mg/mL,酶法132.67mg/mL,TNBIO高壓破碎法111.67mg/mL,反復(fù)凍融法40.67mg/mL,其中酸洗玻璃珠法提取的蛋白含量最高,酶法相比于超聲波破碎法和高壓破碎法蛋白含量較高,可能是前者處理過(guò)程中有大量的酶蛋白的參入,而酶法破碎需要更長(zhǎng)的時(shí)間才對(duì)細(xì)胞破碎有效果。通過(guò)測(cè)定280處吸光值,可間接反映細(xì)胞中總蛋白的釋放情況以及酵母細(xì)胞的破碎程度,結(jié)合各種方法細(xì)胞破碎率結(jié)果,確定酸洗玻璃珠法作為在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中提取酵母細(xì)胞蛋白的的方法。3.3對(duì)5-fpk-c細(xì)胞存在特征的分析釀酒酵母野生型菌株BY4741、抗性菌株BY4741酵母野生型菌株BY4741、5-FC抗性菌株B