克氏原螯蝦用產(chǎn)芽孢益生菌的特性研究

克氏原螯蝦用產(chǎn)芽孢益生菌的特性研究

抗生素促進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，但由于濫用而造成的藥物殘留和對病原體的耐藥性等問題日益突出。芽孢桿菌屬(Bacilluscohn)的益生菌是具有潛力的替代抗生素的產(chǎn)品。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和生產(chǎn)實(shí)踐，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)等在水產(chǎn)養(yǎng)殖中表現(xiàn)出多種有益作用，包括促生長、激活免疫應(yīng)答、提高抗病力、凈化水質(zhì)等(受利益驅(qū)動(dòng)，益生菌制造商通常過于關(guān)注益生效應(yīng)，而對其安全性評價(jià)的重視度不夠(在克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的規(guī)?；B(yǎng)殖中常大量使用芽孢桿菌，為了解市售產(chǎn)品的現(xiàn)狀，本研究從動(dòng)保產(chǎn)品中分離出19株芽孢桿菌，并評價(jià)其益生作用、穩(wěn)定性和安全性，以期望對動(dòng)保產(chǎn)品中芽孢桿菌的科學(xué)評價(jià)和合理使用提供參考。1結(jié)果與分析1.1bacies反應(yīng)從市售樣品共分離到19株芽孢桿菌屬的成員，其中5株(B8,B14,B18,B23,B40)為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),10株(B10,B20,B21,B22,B24,B27,B41,B42,B43,B44)為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),2株(B26,B38)為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus),1株(B31)為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis),1株(B45)為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。1.2益生功能評價(jià)1.2.1病原菌無抑制作用有13株芽孢桿菌對測試的某種或幾種病原菌有抑制作用，6株(B10,B26,B38,B41,B42,B43)對測試病原菌無抑制作用；14株芽孢桿菌可以降解纖維素，5株(B21,B31,B38,B41,B44)不能降解纖維素酶(表1)。1.2.2菌落生長情況培養(yǎng)溫度為15℃時(shí)，生長速度排前3位的菌株是分別是B14、B26和B40，而B17、B22、B31、B41、B44、B45株在272h肉眼未見菌落。培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，生長最快的菌株是B26和B45。當(dāng)培養(yǎng)溫度是37℃時(shí)，生長最快的菌株是B42和B18(圖1)。1.3穩(wěn)定性評估1.3.1芽孢對高溫、低ph和時(shí)間的熱處理分離株B14、B18、B21、B22、B31、B38、B44的芽孢可完全耐受90℃、10min的熱處理。分離株B14、B21、B22、B31、B38、B44的芽孢可完全耐受100℃、5min的熱處理。除了分離株B41和B44的芽孢外，其余芽孢能耐受pH=1溶液處理2h。除分離株B8和B45株的芽孢外，其余芽孢能耐受10%膽汁酸處理2h(表2)。1.3.2芽孢桿菌的自聚集性在37℃孵育24h后，除B18、B20、B26、B38外，其余芽孢桿菌的自聚集性均到達(dá)70%以上。分離株的表面疏水性均不高，最高為B38株，其表面疏水率為27.78%(圖2)。1.4安全評估1.4.1益生菌對15種藥物的敏感性利用K-B法測19株芽孢桿菌對14種常用抗菌藥物的敏感性，其中B10、B24和B31對氨芐西林耐藥，B18、B22和B23對四環(huán)素耐藥，B21對氟苯尼考耐藥，B23和B24還對多西環(huán)素耐藥，B40對甲氧氨芐嘧啶耐藥，其余的益生菌對14種常用抗生素均敏感或中敏(表3)。1.4.2第二、高血小板-溶血活性有8株芽孢桿菌(B10,B14,B21,B24,B26,B40,B43和B45)具有β-溶血活性(圖3)，這些菌株能否作為益生菌的候選株，還需要進(jìn)行動(dòng)物安全試驗(yàn)。1.4.3大鼠疾病選擇能抗病原菌、產(chǎn)纖維素酶和15℃下生長良好、但有溶血活性的B14和B40菌株，進(jìn)行動(dòng)物安全試驗(yàn)。慢性攻毒試驗(yàn)(101.4.4飼料轉(zhuǎn)化效率的影響因素實(shí)驗(yàn)組的增重率和特定生長率的平均值高于對照組的，表明B14和B40對克氏原螯蝦的生長具有一定的益生作用。實(shí)驗(yàn)組的料肉比的平均值均比對照組的要高，這也提示B14和B40對克氏原螯蝦的飼料轉(zhuǎn)化效率存在著負(fù)面影響(表4)。在解剖A、B、C實(shí)驗(yàn)組的克氏原鰲蝦時(shí)，發(fā)現(xiàn)其腸道充血，而對照組D組并沒有出現(xiàn)腸道充血(圖4)。在植物分類等級門的水平上，各實(shí)驗(yàn)組和對照組之間的細(xì)菌群落組成相對豐度的變化不大；但在屬水平上，B14、B40、B14和B40處理組的氣單胞菌屬(Aeromonas)相對豐度分別為(35.29±5.98)%、(17.12±6.71)%、(34.90±26.57)%，均高于對照組的(9.85±1.35)%,且差異顯著(圖5)。2對克氏原螯蝦的影響拮抗病原菌、具備產(chǎn)纖維素酶活性，是篩選水產(chǎn)用益生芽孢桿菌的常見指標(biāo)(Guoetal.,2016;B14和B40菌株存在溶血活性，但在小鼠急性或慢性攻毒試驗(yàn)中，并未證實(shí)其有害影響。B14和B40菌株對克氏原螯蝦生長影響的試驗(yàn)結(jié)果表明，B14和B40菌株有促進(jìn)生長的作用，但又存在降低飼料轉(zhuǎn)化效率的作用。在解淀粉芽孢桿菌B14和B40株可引起克氏原螯蝦腸炎。具有溶血活性的益生菌蠟樣芽孢桿菌可引起小鼠腸炎(制藥和生物技術(shù)公司推進(jìn)了益生菌商業(yè)化，但越來越多的動(dòng)物用益生菌被發(fā)現(xiàn)可能存在安全隱患。如3材料和方法3.1菌株和培養(yǎng)基含有芽孢桿菌的市售動(dòng)保產(chǎn)品。金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC25923)、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila(17J051)、大腸桿菌Escherichiacoli(ATCC25922)、凡隆氣單胞菌Aeromonasveronii(17J071)由本實(shí)驗(yàn)室保存。3.2選擇芽桿菌的分離和鑒定參考3.3益生功能分析參考采用單菌落NA平板培養(yǎng)法測定分離的芽孢桿菌在15、25、37℃的生長速度。至少測定3個(gè)重復(fù)。3.4穩(wěn)定性分析參考Guo等(2016)的方法測定芽孢桿菌的芽孢對高溫、低pH和高膽汁酸鹽的耐受能力。3.5動(dòng)物試驗(yàn)和投喂芽孢桿菌對抗生素的敏感性分析。采用K-B法測試芽孢桿菌對14種常用抗生素的敏感性，參照芽孢桿菌溶血性分析。分離的芽孢桿菌在兔血平板上進(jìn)行劃線。37℃下培養(yǎng)24h，觀察是否出現(xiàn)溶血圈。小鼠致病性分析。綜合抗菌活性、產(chǎn)纖維素酶活性，選擇15℃生長最快的B14和B40為獲選株。為確定有溶血活性的B14和B40株的安全性，進(jìn)行下面的動(dòng)物試驗(yàn)。B14、B40菌株分別在TSB中經(jīng)37℃、24h增菌，PBS洗滌后調(diào)整菌液濃度分別達(dá)到10對克氏原鰲蝦生長和腸道微生態(tài)的影響。用PBS將B14和B40菌株洗滌后調(diào)整濃度至10在2周以上的試驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)中，剔除死亡蝦。剩余活力好的蝦(80只)分為A、B、C、D共4個(gè)組。稱量實(shí)驗(yàn)蝦的初始體重后，連續(xù)投喂20d，記錄每天投喂飼料量，試驗(yàn)結(jié)束稱量蝦的終體重。每組選取6只蝦采集腸道內(nèi)容物，送聯(lián)川生物公司進(jìn)行16SrDNA測序。3.6間差異的分析所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，組間差異用單因素ANOVA分析。P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0完成。數(shù)據(jù)