克氏原螯蝦pccyc基因克隆與功能驗證

克氏原螯蝦pccyc基因克隆與功能驗證

循環(huán)蛋白基因（cyc基因）是明末清初生物基因的重要基因之一。生物鐘是機體內(nèi)部周期性接近24h自我維持的時鐘。這個時鐘由分子振蕩器組成,分子振蕩器由轉(zhuǎn)錄激活因子和時鐘本身及其他基因的抑制劑組成,分別形成正負(fù)循環(huán)克氏原螯蝦(1材料和方法1.1模擬克氏原螯蝦的生長試驗用克氏原螯蝦樣品于徐州(云龍區(qū)周邊水域)野外捕捉采集,為除去性別的干擾,在進(jìn)行試驗時全部選取體長9～11cm的雄性個體?；铙w樣本采集完畢后,需要進(jìn)行光照馴化。在實驗室循環(huán)水箱中飼養(yǎng)15d,溫度恒定25℃,24h充氧,箱底鋪滿沙石,并放置尼龍管和石塊,模擬克氏原螯蝦自然生境躲避模式。用全光譜日光燈模擬室外光照,光暗比12L∶12D(12LD)。馴化15d之后將樣品分成3組:第1組是馴化15d之后的樣品直接用于試驗;第2組從中選取健康的雄性個體54只轉(zhuǎn)入24h持續(xù)黑暗中0L∶24D(24DD);第3組選取健康的雄性個體54尾轉(zhuǎn)入72h的持續(xù)黑暗中0L∶72D(72DD)。不同光照條件下的克氏原螯蝦均在同一水箱中培養(yǎng)。在不同的光照模式下分別培養(yǎng)結(jié)束后,于時間點7:00、11:00、15:00、19:00、23:00、翌日03:00、7:00進(jìn)行取樣。每個時間點每組取2尾,共取3個平行對照組。使用的試驗操作程序經(jīng)南京師范大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會[SOXR(江蘇)2015-028]批準(zhǔn)。試驗所用引物名稱及序列見表1,引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。1.2方法1.2.1rna的質(zhì)量和純度將克氏原螯蝦的肝胰腺、腦、眼柄組織按照Trizol試劑說明書提取總RNA,用ThermoNanoDrop2000/2000C(ThermoFisherScientific,USA)分光光度計和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量和純度,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript1.2.2pccyc基因發(fā)現(xiàn)序列的克隆和確定序列根據(jù)從克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組中(Accessioncode:SRP044128)1.2.3合成cdna的程序選取已驗證的EST序列,用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計3′RACE和5′RACE的特異性引物和巢式PCR反應(yīng)的特異性引物。先對5′RACEPCR進(jìn)行前處理再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對提取的總RNA進(jìn)行CIAP、TAP處理,與5′RACEAdaptor連接后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。之后進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。同樣對3′RACEPCR進(jìn)行前處理,合成cDNA時要設(shè)立M-MLV(-)對照。反應(yīng)體系:TotalRNA(1μg/μL)1μL,3′RACEAdaptor(5μmol/L)1μL,dNTPMixture(10mmol/Leach)1μL,RNaseFreedeionizedH1.2.4pcr擴增及電泳檢測為驗證RACEPCR擴增的序列是否正確,以EST序列驗證時的cDNA為模板,使用高保真酶,Cycle-QCF/Cycle-QCR為引物,進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系及條件同EST序列驗證。反應(yīng)結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。根據(jù)檢測結(jié)果確定使用PCR產(chǎn)物直接純化還是凝膠回收[使用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0(TaKaRa,大連)切膠回收PCR產(chǎn)物],用Cycle-QCF/Cycle-QCR對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。1.2.5蛋白質(zhì)框架、疏水性和結(jié)構(gòu)預(yù)測利用美國國立生物技術(shù)信息中心(/BLAST)Blast驗證PcCyc基因的cDNA全長。用ORFFinder查找PcCyc基因的開放閱讀框。在線服務(wù)器ExPASy的ProtParam工具分析PcCYC蛋白相關(guān)的理化性質(zhì)。在線軟件MotifScan可以用來搜索PcCYC蛋白的motif。分別用在線服務(wù)器ExPASy的ProtScale工具和在線軟件SignalP分析PcCYC蛋白的疏水性和預(yù)測分析信號肽。TMHMMServerv.2.0預(yù)測分析PcCYC蛋白跨膜區(qū)。在線軟件PSORTⅡPrediction預(yù)測分析PcCYC蛋白結(jié)構(gòu)域。PcCYC蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用PSIPRED。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析使用在線服務(wù)器ZhangLab。1.2.6不同日夜節(jié)奏表的表達(dá)克氏原螯蝦不同光照的樣本用Trizol法進(jìn)行總RNA提取;并各取500ng用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript2結(jié)果2.1生物酶抑制劑yc基因開放閱讀框序列的擴增驗證5′RACEPCR和3′RACEPCR產(chǎn)物經(jīng)測序分別得到312bp的5′端序列,1185bp和1129bp的3′端序列。經(jīng)測序驗證結(jié)果表明獲得的RACEPCR產(chǎn)物序列是根據(jù)已知EST序列擴增所得(圖1)。PcCyc基因開放閱讀框序列擴增驗證見圖2。PcCyc基因的cDNA部分序列分析結(jié)果顯示,它具有一個143bp的5′端非翻譯區(qū)(UTR),本試驗中并未獲得3′端非翻譯區(qū),其開放閱讀框包含2010個堿基(GenBank登錄號MN908586),編碼669個氨基酸。PcCyc基因的開放閱讀框中還包含一個典型的bHLH/PAS轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)。翻譯過程中起始密碼子為ATG(位于144～146位),終止密碼子為TGA,在本試驗中獲得的序列A+T含量為56.5%,G+C含量為43.5%。自美國國立生物技術(shù)信息中心下載Cyc基因產(chǎn)物蛋白的同源序列,使用在線軟件PortalCIPES基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,發(fā)現(xiàn)PcCyc基因與甲殼類的Cyc基因聚為一支,且與十足目通訊螯蝦(2.2pclc蛋白特征分析2.2.1蛋白質(zhì)理化特性PcCYC蛋白的理化性質(zhì)分析使用在線ProtParam工具進(jìn)行,對克氏原螯蝦PcCYC蛋白質(zhì)的理化參數(shù)分析顯示,PcCYC蛋白的分子量約為73.963ku,理論等電點為6.56,原子總數(shù)為10222個,化學(xué)分子式為C2.2.2pccyc蛋白的motif搜索PcCYC蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析采用SMART在線軟件進(jìn)行,分別給出了PcCYC蛋白結(jié)構(gòu)功能域及其相關(guān)信息(圖4)。預(yù)測結(jié)果顯示,PcCYC蛋白含有BHLH/PAS結(jié)構(gòu)域,包括1個HLH結(jié)構(gòu)域和2個PAS結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域可以相互作用形成異二聚體,并結(jié)合下游基因的E-Box區(qū)域,行使其生物學(xué)功能。PcCYC蛋白的Motif搜索利用在線軟件MyhitsMotifScan進(jìn)行。結(jié)果顯示,PcCYC蛋白可能包含19個酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點,14個蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點,12個豆蔻酸化位點等(圖2)。2.2.3ccyc信號肽預(yù)測模型SignalP4.1Server工具分析PcCYC蛋白并沒有發(fā)現(xiàn)信號肽,因此該蛋白為非分泌蛋白,會直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),易于富集,在細(xì)胞核中將與PcCLK蛋白形成異二聚體行使其生物學(xué)功能。2.2.4亞細(xì)胞定位算法采用PSORTⅡPrediction在線服務(wù)器對PcCYC蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。結(jié)果顯示,PcCYC蛋白位于細(xì)胞核的可能性為95.7%,定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性為4.3%,因此PcCYC蛋白為核蛋白,主要存在細(xì)胞核中。2.2.5pccyc蛋白三次成分預(yù)測采用PSIPRED在線服務(wù)器預(yù)測PcCYC蛋白的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,PcCYC蛋白含有11個α-螺旋、12個β-折疊、24個無規(guī)則卷曲。采用在線服務(wù)器ZhangLab對PcCYC蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。圖5中黃色代表β-折疊,藍(lán)色代表α-螺旋,紅色代表無規(guī)則卷曲;同時PcCYC蛋白含有2個PAS結(jié)構(gòu)域、一個BHLH結(jié)構(gòu)域被分別標(biāo)出,它們是PcCYC蛋白與其他蛋白互作行使功能的結(jié)構(gòu)域。2.2.6蛋白質(zhì)疏水性采用在線服務(wù)器ExPASy的ProtScale工具對PcCYC蛋白的疏水性進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示,PcCYC蛋白的最高峰值為2.554,最低峰值為-3.578,表明PcCYC蛋白為疏水性蛋白。2.3pccyc基因檢測以β-actin基因作為內(nèi)參,使用實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)檢測了不同光照條件下PcCyc基因在腦、肝胰腺和眼眪3種組織中的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果表明,3種光照條件下,PcCyc基因在眼柄和肝胰腺中都基本遵循著24h的節(jié)律振蕩,而在大腦中的節(jié)律振蕩隨光照周期改變被打破(圖6)。12LD的光照條件下,大腦與眼柄中PcCyc基因基本上有相似的表達(dá)規(guī)律,但在24DD的光照條件下,相似的規(guī)律被打亂了。在24DD光照條件下克氏原螯蝦眼柄中PcCyc基因表達(dá)高峰比12LD條件下的提前了4h,在72DD條件下,節(jié)律振蕩恢復(fù),但是與12LD的節(jié)律規(guī)律略有區(qū)別。3討論生物鐘一直是科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點問題,它是生命對地球光照以及溫度等環(huán)境因子周期變化長期適應(yīng)而演化的內(nèi)在自主計時機制3.1理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)分析本試驗中使用PcCyc基因翻譯的氨基酸序列對PcCYC蛋白進(jìn)行相關(guān)的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域分析。其中功能結(jié)構(gòu)域分析PcCYC蛋白含有典型的bHLH/PAS轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域,在CYC蛋白中該結(jié)構(gòu)域的主要功能是與CLK蛋白結(jié)合成異二聚體在時鐘調(diào)控網(wǎng)中行使功能3.2不同光周期內(nèi)，克隆原頭蝦pcc基因的組織表現(xiàn)進(jìn)行了模式分析Escamilla-Chimal等4不同光照條件對克氏原螯蝦pccyc基因表達(dá)的影響在本試驗中,采用RACEPCR技術(shù)克隆了克氏原螯蝦的核心生物鐘基因PcCyc的部分cDNA序列(2153個堿基),包括2010個堿基的開放閱讀框(編碼669個氨基酸);同時利用實時熒光定量PC