QIAGEN試劑盒提取RNA說(shuō)明書中文翻譯

1:細(xì)菌的溶菌酶破碎2:細(xì)菌的溶菌酶破碎和機(jī)械破碎3:細(xì)菌的機(jī)械破碎4:細(xì)菌的溶菌酶裂解和蛋白酶K的消化5:細(xì)菌的溶菌酶裂解、蛋白酶K的消化及機(jī)械破碎6:固體培養(yǎng)基細(xì)菌的裂解7:使用RNeasyMiniKit從細(xì)菌溶解物中提純總RNA。8:使用RNeasyMidiKit從細(xì)菌溶解物中提純總RNA。章節(jié)說(shuō)明該手冊(cè)含有兩種不同類型方案。我們提供了多種方案，其中方案1-6是針對(duì)制備細(xì)菌溶解物，方案7-8是針對(duì)如何從細(xì)菌溶解物中提取全RNA。你需要在方案1-6中選擇一種操作，而后在方案7-8中任選其一。制備細(xì)菌溶解物的各個(gè)方案都介紹了破碎細(xì)菌時(shí)如何固定RNA。如何選擇不同的實(shí)驗(yàn)方案由細(xì)菌細(xì)胞壁的穩(wěn)定性所決定。細(xì)菌細(xì)胞壁的穩(wěn)定性受多個(gè)因素影響，包括細(xì)菌種類、生長(zhǎng)階段和培養(yǎng)基的成分。細(xì)菌必須完全破碎以確保RNA的有效提取。制備細(xì)菌溶解物的各個(gè)方案都包含了不止一步。■酶消化：細(xì)菌細(xì)胞壁可以被溶菌酶進(jìn)行消化（例如溶菌酶、溶葡球菌酶）。我們認(rèn)為溶菌酶的作用對(duì)于所有的革蘭氏陽(yáng)性、陰性細(xì)菌均是有效的?！龅鞍酌窴消化:在復(fù)雜培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌大部分蛋白質(zhì)可以被蛋白酶K消化以提高RNA的純化率。我們認(rèn)為蛋白酶K對(duì)于可在復(fù)合培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌均是有效的。蛋白酶K常常用于提高革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌RNA。另外，若從大量原材料中提取RNA，蛋白酶K可以有效提高RNA產(chǎn)率?！鰴C(jī)械破碎：細(xì)菌細(xì)胞壁的機(jī)械破碎可以使用組織研磨機(jī)和玻璃微珠。機(jī)械破碎法對(duì)于絕大多數(shù)的細(xì)菌來(lái)說(shuō)都是適用的。機(jī)械破碎法與酶消化法相結(jié)合可以極大程度的提高RNA產(chǎn)率。盡管本手冊(cè)中的機(jī)械破碎方案均為使用組織研磨機(jī)，但采用其他的破碎方法是完全可行的。考慮到細(xì)菌種類的多樣性以及培養(yǎng)條件的多樣性，細(xì)菌溶解物的制備方案（方案1-6）必須謹(jǐn)慎選擇。在第10頁(yè)中介紹了制備細(xì)菌溶解物的不同方案，第11頁(yè)（表格一）則提供了這些方案概況以便于參考選擇。方案一：細(xì)菌的酶消化該方案僅涉及到酶消化。我們建議該方案適用對(duì)象為生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基的為短世代的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌方案二：細(xì)菌的酶消化以及機(jī)械破碎該方案涉及到在機(jī)械破碎過程中使用酶進(jìn)行消化。我們建議該方案的使用對(duì)象為生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基上的革蘭氏陰性細(xì)菌和易于破碎的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。方案三：細(xì)菌的機(jī)械破碎該方案僅涉及到機(jī)械破碎，廣泛適用各類細(xì)菌，但是使用該方案相比于其他方案會(huì)取得更低的RNA產(chǎn)率。方案四：細(xì)菌的酶消化和蛋白酶K處理該方案主要是溶菌酶與蛋白酶K的共消化。我們建議該方案適用于生長(zhǎng)在復(fù)雜培養(yǎng)基的革蘭氏陰性細(xì)菌和生長(zhǎng)在基本或復(fù)雜培養(yǎng)基上的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。方案五：細(xì)菌的酶消化、蛋白酶K消化和機(jī)械破碎該方案主要是在機(jī)械破碎過程中使用酶消化、蛋白酶K消化共處理。我們建議該方案適用于生長(zhǎng)在基本或者復(fù)雜培養(yǎng)基上的難以破碎的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。方案六：固體培養(yǎng)基細(xì)菌的破碎該方案適合生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌。細(xì)菌細(xì)胞可以通過溶菌酶的消化并同時(shí)加入蛋白酶K或者使用機(jī)械破碎。方案七：使用RNeasyMiniKit從細(xì)菌溶解物中提取全RNA該方案就使用RNeasyMiniKit從每份樣品中提出最高100用的RNA。該方案所需使用的細(xì)菌溶解物可以通過方案1-6中的其中一個(gè)進(jìn)行制備。方案八：使用RNeasyMidiKit從細(xì)菌溶解物中提取全RNA該方案就使用RNeasyMidiKit從每份樣品中提出最高1mg的RNA。方案所需使用的細(xì)菌溶解物可以通過方案1-6中的其中一個(gè)進(jìn)行制備。Table1.OverviewofProtocolsforPreparingLysatesofBacterialCellsbacteriaCultureProtocolnumberEnzymoticlysisProteina&eKdigestionMechanicaldisruptionGram-Minimal1*YesNoNonegativemedia2YesNoYesGram-Complex4YesYesNonegativemediaGram-Minimal2-YesNoYespositivemedia4YesYesNo5YesYesYesGram-Complex4:YesYesNopositivemedLa5YesYesYesMixtureofMinimalor3NoNoYesdifferentcomplexspecie5mediaGram-SolidmediaYesOptionalOptionalnegativeorGrampositive注意：對(duì)于某些種類的細(xì)菌或者培養(yǎng)條件而言，使用苯酚-異硫氰酸胍基礎(chǔ)裂解緩沖液可以提升RNA的產(chǎn)率。該手冊(cè)的附錄部分含有描述通過與RNeasyLipidTissueMiniKit（包括了苯酚-異硫氰酸胍基礎(chǔ)裂解緩沖液）結(jié)合使用的RNAprotectBacteriaReagent來(lái)固定并提取細(xì)菌RNA。附錄C（第41頁(yè)）是為大多種類細(xì)菌而制備的方案，介紹了溶菌酶和自行選擇的蛋白酶K消化通過加熱QIAzol反應(yīng)液和RNA提取。附錄D（第44頁(yè)）是為某些特定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌制備的方案，介紹了在加熱的QIAzol反應(yīng)液中的溶菌酶消化、蛋白酶K消化、機(jī)械破碎，而后進(jìn)行RNA提取。實(shí)驗(yàn)人員需自備的儀器和試劑因?qū)嶒?yàn)常接觸化學(xué)藥劑，請(qǐng)穿戴實(shí)驗(yàn)服、一次性手套和護(hù)目鏡。更多信息，請(qǐng)查詢MSDSs，可通過供貨商購(gòu)買。方案須知■滅菌的，無(wú)RNase槍頭■恰當(dāng)型號(hào)的離心管和微型離心機(jī)或者適當(dāng)轉(zhuǎn)子的離心機(jī)■一次性手套■渦旋器■震蕩孵育箱涉及酶解的方案(第十一頁(yè)，表一)■胞壁質(zhì)酶或者合適的溶解酶■配置TE緩沖液所需的Tris和EDTA涉及蛋白酶K消化的方案(第十一頁(yè)，表一)QIAGEN蛋白酶K涉及機(jī)械破碎的方案(第十一頁(yè)，表一)■組織破碎器■玻璃微珠涉及RNeasyKits的方案14.3Mb-巰基乙醇RNeasyMiniKit,RNeasyMidiKit,RNeasyProtectBacteriaMiniKit,或者RNeasyProtectBacteriaMidiKit■乙醇(96-100%)、乙醇(80%)或者乙醇(70%)■建議：RNase-FreeDNaseSet重要事項(xiàng)最佳的培養(yǎng)條件為確?；虮磉_(dá)的準(zhǔn)確性以及可重復(fù)性，以下幾點(diǎn)需實(shí)驗(yàn)人員注意■培養(yǎng)基：我們建議使用基本培養(yǎng)基，因?yàn)榛九囵B(yǎng)基成分更加明確，相比于復(fù)合培養(yǎng)基具有更少的可變因素?！鍪占?xì)胞的時(shí)間：細(xì)胞應(yīng)當(dāng)在對(duì)數(shù)中期進(jìn)行收集。在這一階段，培養(yǎng)條件處于穩(wěn)定狀態(tài)。細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)也沒有消耗，因?yàn)楦叨鹊男玛惔x活動(dòng)使RNA也處于極高的水平。另外，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，細(xì)胞壁將變得難以滲透進(jìn)去，這回在RNAprotectBacteriaReagent固定RNA的過程中降低滲透速率及效果。RNA產(chǎn)率受到細(xì)菌細(xì)胞世代時(shí)間很大影響，我們因此建議使用新鮮培養(yǎng)基。正確選擇起始材料的使用量我們使用RNeasyKits從細(xì)菌溶解物中提取RNA，起始材料的使用量十分重要，需仔細(xì)計(jì)算。有兩個(gè)因素需要考慮：RNeasy離心柱的RNA結(jié)合力：RNeasyMinispincolumn最高生產(chǎn)量為每份100昭，RNeasy7070Midispincolumn為每份1mg?！鯮NAprotectBacteriaReagent在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的作用效果以及可以起到有效溶菌作用的RLT體積：每RNeasyMini離心柱最多為7.5x108細(xì)胞數(shù)目，每份RNeasyMidi離心柱為5x108-7.5x109細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞數(shù)目最大值是以在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌為參考。因?yàn)椴煌N類的細(xì)菌會(huì)表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，也可能因培養(yǎng)條件不同而產(chǎn)生區(qū)別，所以細(xì)胞最大數(shù)目常常是有所差別的。Theselimitingfactorsareillustratedinthefollowing2examples,whichshowthecalculationoftheamountofE.colitoapplytoanRNeasyMinispincolumn:相關(guān)的因素將在以下的兩個(gè)例子中闡述,主要是介紹了使用大腸桿菌E.coligrowninRNAyieldapproximately40|igper7.5x108cells.Uptominimalmedium7.5x108cellscanbeused(useofhighernumbersofcellsresultsininefficientlysisandreducedyield).E.coligrowninRNAyieldapproximately120|igper7.5x108cells.UptoLBmedium6x108cellscanbeused(100|igRNAisthemaximumbindingcapacityoftheRNeasyMinispincolumn).Table2showsthetypicalRNAyieldsfrombacterialcellsgrownindifferentculturemedia.Note:IftheRNAbindingcapacityoftheRNeasyspincolumnisexceeded,orifcelllysisisincompleteduetotheuseofexcessstartingmaterial,theyieldandpurityofthepurifiedRNAwillbesignificantlyreduced.BacterialspeciesulturemediumNo.cellsRNAyield(^g)iE.coliMinimalmedium5x10825E.coliLB5x108B.subtilisMinimalmedium1x1088B.subtilisLB1x10815Table2.TypicalYieldsofTotalRNAfromTwoBacterialSpeciesGrowninDifferentCultureMedia**BacterialcellsdisruptedaccordingtoProtocol1.tWerecommendminimalmediaforgrowingbacteria.iYieldscanvaryduetofactorssuchasgenerationtimeandgrowthconditionsused.Inaddition,followingtheprotocolsformechanicaldisruptionofcells(Protocols2,3,and5)mayincreaseyields.SincetheRNeasyprocedureenrichesformRNAandotherRNAs>200nucleotides,thetotalRNAyielddoesnotincludequantitativeamountsof5SRNA,tRNA,andotherlow-molecular-weightRNAs,whichmakeup1520%oftotalcellularRNA.IfyourstartingmaterialisneitherE.colinorB.subtilisandyoudonotknowitsRNAcontent,werecommendusingnomorethan2x108cellsperRNeasyMinispincolumnor2x109cellsperRNeasyMidispincolumninthefirstpurificationprocedure.DependingonRNAyieldandpurity,itmaybepossibletoincreasethenumberofcellsinsubsequentprocedures.TooptimizeRNAyields,werecommendperformingpilotexperimentsinwhichRNAispurifiedfromdifferentamountsofcells.QuantifyingbacterialcellsBacterialgrowthisusuallymeasuredusingaspectrophotometer.However,itisverydifficulttogivereliablerecommendationsfortherelationshipbetweenODvaluesandcellnumbersinbacterialcultures.ODreadingsareinfluencedbyfactorssuchasbacterialspeciesandphysiology,sinceODreadingsmeasurelightscatteringratherthanabsorption.Measurementsoflightscatteringdependonthedistancebetweenthesampleandthedetector,andreadingsfromdifferenttypesofspectrophotometerthereforevary.Furthermore,differentspeciesshowdifferentODvaluesatcertainwavelengths(e.g.,600nmor436nm).Bacterialphysiologycanbeinfluencedbyvariousfactors(e.g.,culturemedia,temperature,andshakerspeed).WethereforerecommendcalibratingyourspectrophotometerbycomparingODreadingsatappropriatewavelengthswithviablecelldensitiesdeterminedbyplatingexperiments.*ODreadingsshouldbebetween0.05and0.3toensurereliability.SampleswithODreadingsabove0.3shouldbedilutedsothattheODreadingsfallwithinthisrange;thedilutionfactorsareusedwhencalculatingthenumberofcellsperml.Thefollowingcalculationmaybehelpfulasaroughguide.AnE.colicultureof1x109cells/mlisdiluted1:4,andgivesOD600readingsof0.25withaBeckmanDU?-7400spectrophotometeror0.125withaBeckmanDU-40spectrophotometer.ThesecorrespondtocalculatedODreadingsof1.0or0.5,respectively,for1x109cells/ml.HandlingandstoringstartingmaterialRNAprotectBacteria