細(xì)胞工程植物細(xì)胞培養(yǎng)

植物細(xì)胞制備機(jī)械法酶法愈傷組織誘導(dǎo)法

不斷繼代培養(yǎng)愈傷組織，通過流體剪切力和振動(dòng)，使植物細(xì)胞從結(jié)構(gòu)非常松散的愈傷組織中釋放出來(lái)，得到懸浮的植物細(xì)胞植物細(xì)胞分離

--懸浮培養(yǎng)系建立調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組分疏松的愈傷組織在液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)若干次建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞系

植物細(xì)胞特性葉綠體液泡細(xì)胞核細(xì)胞膜內(nèi)網(wǎng)質(zhì)膜線粒體高爾基體與微生物的比較

植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生代謝

類似于青霉素的生產(chǎn)，大多植物有效成分積累與細(xì)胞生長(zhǎng)非關(guān)聯(lián)，而往往在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)平衡時(shí)開始次生代謝物積累于細(xì)胞胞內(nèi)的液泡中，分離提取首先需要破碎細(xì)胞培養(yǎng)基一、無(wú)機(jī)鹽二、碳源三、植物生長(zhǎng)激素四、有機(jī)氮源五、有機(jī)酸六、復(fù)合物質(zhì)植物生長(zhǎng)激素2,4-D：10to50μMNAA：1to50μMKinetin：0.1to10μMIAA：0.1to10μM傳統(tǒng)反應(yīng)器轉(zhuǎn)筒反應(yīng)器適合于慢反應(yīng)ABC大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)提高次生代謝物產(chǎn)量的策略

高產(chǎn)細(xì)胞系的建立和選擇：克隆選擇、抗性選擇和誘導(dǎo)選擇

組織化培養(yǎng)：根系培養(yǎng)固定化細(xì)胞技術(shù)：凝膠包埋法、吸附法

產(chǎn)物促進(jìn)釋放技術(shù)：改變培養(yǎng)基組成、電刺激法、二甲基亞砜（DMSO）類物質(zhì)的化學(xué)滲透法、由培養(yǎng)基與萃取劑組成的雙液相培養(yǎng)

原生質(zhì)體的制備—去除細(xì)胞壁的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體細(xì)胞融合育種用途功能繁殖代謝分化

化合物

植物品系得率(%干重)

培養(yǎng)類型細(xì)胞培養(yǎng)植物紫草寧紫草201.5s人參皂甙西洋參Panaxginseng274.5c蒽醌Morindacitrifolia180.3sAjmalicine長(zhǎng)春花Catharanthusroseus1.00.3sRosmarinicacidColeusblumeii153sUbiquinone-10Nicotianatabacum0.0360.003sDiosgeninDioscoreadeltoides22sBenzylisoquinolineAlkaloidsCoptisjaponica115-10sBerberineThalictrumminor100.01sBerberineCoptisjaponica102-4sAnthraquinonesGaliumverum5.41.2sAnthraquinonesGaliumaparine3.80.2s尼古丁煙草Nicotianatabacum3.42.0cBisoclaurineStephaniacepharantha2.30.8sTripdiolideTripteryqiumwilfordii0.050.001s*s=suspension;c=callus植物細(xì)胞產(chǎn)生的次生代謝物植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物

——藥品及生物活性物質(zhì)

生物堿Alkaloids

嗎啡楠堿Morphinanalkaloids

小檗堿Berbeirine

莨菪烷Tropanealkaloids

強(qiáng)心苷Cardinolides*

毛地黃毒苷是一種強(qiáng)心苷類。毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)物能夠進(jìn)行植株所不能夠或能極微量進(jìn)行的生物合成過程。

抗癌化合物（Antitumorcompounds）

喜樹堿CamptothecinHomoharringtonine

鬼臼毒Podophyllotoxin

紫杉醇（Taxol）

西洋參（Ginseng）*迷迭香酸Rosmarinicacid

對(duì)苯二酚葡糖苷Arbutin植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物

——食品添加劑Foodadditives

色素Pigments

紫草寧

shikonincompounds*

花青素

Anthocyanins$1,250-2,000/kg

紅花黃色素，紅花素carthamin是其主要成分

藏紅花Saffron

茜草色素MadderColorants

其它

糖膠樹膠Chicle

（口香糖樹膠）香豆素紫草寧的生產(chǎn)（1）

8種衍生物的總稱傳統(tǒng)中藥與天然色素懸浮紫草細(xì)胞的制備采用種子萌動(dòng)法誘導(dǎo)紫草愈傷組織

紫草種子在25

C黑暗中萌動(dòng)，然后轉(zhuǎn)移于LS培養(yǎng)基進(jìn)行固體培養(yǎng)，激素水平為2,4-D10-6mol/L，KT10-5mol/L。一星期后在芽的下端產(chǎn)生了乳黃色愈傷組織。紫草寧分泌愈傷組織若在固體LS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并將激素改為添加IAA，4周后可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變?yōu)樯罴t色，此物質(zhì)即紫草寧

懸浮細(xì)胞系建立

將愈傷組織繼代培養(yǎng)在液體LS培養(yǎng)基中，經(jīng)多次培養(yǎng)后可得到懸浮的小顆粒細(xì)胞（幾個(gè)到幾十個(gè)細(xì)胞聚集團(tuán)）紫草寧的生產(chǎn)（2）LS細(xì)胞生長(zhǎng)White紫草寧積累兩階段LS-White培養(yǎng)改進(jìn)的優(yōu)化兩階段培養(yǎng)基M5-M9發(fā)根系培養(yǎng)高密度流加培養(yǎng)紫草寧的生產(chǎn)（2）

發(fā)展與開發(fā)歷史

日本三井石油公司：確定生長(zhǎng)-生產(chǎn)兩階段培養(yǎng)流加高密度培養(yǎng)育種，高產(chǎn)細(xì)胞株篩選

1983年750L氣升式反應(yīng)器

1987年，1m3的轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器中國(guó)：南京大學(xué)生物系浙江大學(xué)材料與化工學(xué)院

人參（Panax

ginseng

）細(xì)胞有效成分皂甙（saponins）和皂甙配基（sapogenins）

研究與開發(fā)歷史

1日本MeijiSeikaKaisha1973年專利大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器后放棄

2美國(guó)UniversityofMinnesota發(fā)現(xiàn)2,4-D和kinetin對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與次生代謝有著不同的調(diào)節(jié)作用

3日本NittoDenkoCorporation80年代中期20立方米罐細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)量達(dá)700mg/L/day

In1988,被theMinistryofWelfareandHealthinJapan準(zhǔn)許以食品添加劑（酒、湯、飲料和草藥提取液）生產(chǎn)西洋參細(xì)胞質(zhì)

現(xiàn)在正等待西洋參細(xì)胞質(zhì)作為藥的審批紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)有效成分：紫杉醇藥效：卵巢癌、乳腺癌、肺癌的高效、低毒、廣譜的抗癌藥物需求：

需求量極大但自然產(chǎn)量有限，最迫切需要通過細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)提供

研究開發(fā)：

美國(guó)：

CatalyticInc.和ESCAgenetics幾年前宣布建立taxol生產(chǎn)過程，但后來(lái)未見進(jìn)一步報(bào)道（DT十幾天）我國(guó)：短葉紅豆杉(T.Brevifolia)和東北紅豆杉（T.Cet