生物技術(shù)概論-基因工程

生

物

技

術(shù)

概

論基

因

工

程南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院

馬驪二〇〇六年五月十一日第一頁，共一百三十八頁。重組DNA技術(shù)的定義種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的

穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子

克隆技術(shù)。供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。第二頁，共一百三十八頁?；蚬こ痰亩x上游技術(shù)

下游技術(shù)上游技術(shù)下游技術(shù)基因工程的理論基礎(chǔ)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；基因是可切割的；基因是可以轉(zhuǎn)移的；多肽和基因之間存在對應(yīng)關(guān)系；遺傳密碼是通用的；基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳給下一代?；蚬こ痰幕驹硖岣咄庠椿虻膭┝俊肿舆z傳學(xué)原理篩選、修飾重組基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件如啟動子、增強子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列——分子生物學(xué)原理篩選、修飾蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件如SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子——分子生物學(xué)原理基因工程菌的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)——生化工程學(xué)原理第五頁，共一百三十八頁?；蚬こ痰闹渭夹g(shù)基因工程的基本條件A

用于核酸操作的工具酶限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶

DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶限制性內(nèi)切核酸酶A中特定核苷酸序列，并在合適反應(yīng)定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生具有3’-OHNA片段的內(nèi)切脫氧核苷酸酶?；蚬こ讨兴玫氖荌I型酶。屬名

種名

株名Haemophilus

influenzae

d嗜血流感桿菌d株Hind

III同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶第九頁，共一百三十八頁。1、限制性內(nèi)切酶的識別順序識別序列2、限制性內(nèi)切酶的酶切位點酶的作用下，DNA雙鏈上磷酸二酯鍵斷開酶切位點，用

表示。酶切位點位于識別序列的側(cè)。如：G

AATTC、

GATC。不同的酶切割DNA分子后產(chǎn)生的末端不同：5’粘性末端、3’粘性末端、平末端。第十一頁，共一百三十八頁。-

-

-G-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-G-

-

--

-

-G-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-G-

-

--

-

-C-T-G-C-A-G-

-

--

-

-G-A-C-G-T-C-

-

--

-

-C-T-G-C-A-OHP-G-

-

--

-

-G-POH-A-C-G-T-C-

-

--

-

-C-A-G-C-T-G-

-

--

-

-G-T-C-G-A-C-

-

--

-

-C-A-G-OHP-C-T-G-

-

--

-

-G-T-C-POH-G-A-C-

-

-同裂酶來源不同，但具有相

的識同。I和Bst

I：識別GGATCC。同尾酶：有些限制性內(nèi)切酶雖識別序列不同，但酶切產(chǎn)生的DNA片段具有相同的末端。如：Taq

I、Cla

I和Acc

I，酶切均產(chǎn)生5’-CG末端。第十五頁，共一百三十八頁。限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的操作0-50

mM

低鹽酶100

mM

中鹽酶150

mM

高鹽酶Volume20

-

100

ulT

T37

℃

1

-

1.5

hr限制性內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶切原則上可以同時酶切，但應(yīng)注意：BamH

I

Sma

I5’

…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3’

…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5’

…

GCTACATG3’

…

CGATGTACCTAGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ggcccAagcgta…5’5’

…GCTACATGGATCCC3’

…CGATGTACCTAGGGGGGTTCGCAT…3’CCCaagcgta…5’第十七頁，共一百三十八頁。影響限制性內(nèi)切酶活性的因素DNA樣品的純度DNA樣品的甲基化程度酶的緩沖液性質(zhì)第十九頁，共一百三十八頁。DNA樣品的純度：加大酶的用量，1mg

DNA

用10U

酶加大反應(yīng)總體積延長反應(yīng)時間DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中dam甲基化酶在5’GATC3’序列中腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的有Bcl

I

Mbo

I等。大腸桿菌中dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的有EcoR

II等哺乳動物中甲基化酶在5’CG3’序列中C5位上引入甲基。酶的緩沖液性質(zhì)：高濃度酶高濃度甘油低離子強度極端pH值等5’GAATTC3’5’AATT3’。DNA連接酶DNA連接酶T4

DNA連接酶用途：提高平端連接效率的方法加大連接酶用量（10倍于粘端的連接）；加大平末端DNA片段的濃度；加入10%PEG

8000；加入單價陽離子（NaCl），終濃度150-200

mM。DNA聚合酶用途：記的DNA探針5’

dNTP5’

ppp

dA（-32P-dATP）5’

…

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’3’

…

C-G-A-G-

-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’DNA

pol

I

Mg2+DNA

pol

I特性：具有5’→3’DNA聚合酶活性、5’→3’和3’→5’外切核酸酶活性。-

-

-

-A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’nickDNase

I5’

…

G-C-T-C

A-G-C-T-G-G-A-G-T…

3’3’

…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…

5’第二十六頁，共一百三十八頁。Klenow酶Klenow酶特性：用途：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端；DNA片段的同位素末端標(biāo)記；cDNA第二鏈的合成；雙脫氧末端終止法測定DNA序列。補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端：-

-

-G-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-G-

-

--

-

-G-A-A-T-T-OHP-A-A-T-T-C-

-

--

-

-C-T-T-A-A-POH-T-T-A-A-G-

-

-DNA片段的同位素末端標(biāo)記：…

G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C

…

5’Klenow5’

ppp

dA（

-32P-dATP）5’

…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…

5’第二十九頁，共一百三十八頁。T4

DNA聚合酶特性：在無dNTP時，從3’-OH端外切；在只有1種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止；在4種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位。用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端；DNA片段的同位素末端標(biāo)記。切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端：-

-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G

…

3’’

…

C-G-A-G-PHO-A-C-G-T-C-C-T-C

…

5T4

DNA

pol5’

…

G-C-T-C-

OH

P-G-G-A-G

…

3’3’

…

C-G-A-G-P

HO

-C-C-T-C

…

5’第三十一頁，共一百三十八頁。反轉(zhuǎn)錄酶特性：用途：核酸酶單鏈核酸外切酶：切酶VII（ExoVII），不需Mg2+；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII），特異性從3’端核酸外切酶（Exo），特異性從5’端外切；單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶，內(nèi)切單鏈DNA或RNA、帶缺口或缺刻的雙鏈DNA；單鏈內(nèi)切雙鏈外切核酸酶：Bal31核酸酶，用于誘發(fā)DNA突變。第三十三頁，共一百三十八頁。Bal

31核酸酶EcoRIABCEcoRIB

CABCAAC核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）：堿性磷酸單酯酶（CIP、BAP

）

：T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）用于探針的末端同位素標(biāo)記。B

用于基因克隆的載體載體的功能及特征質(zhì)粒噬菌體或病毒DNACos質(zhì)粒人工染色體載體載體的功能及特征載體的功能：載體應(yīng)具備的條件：特征:1、質(zhì)粒（plasmid）質(zhì)粒的構(gòu)建pSC101ColE18.8

kb

拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因Tcr6.5

kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124

ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr人工構(gòu)建的質(zhì)粒分成如下幾類：高拷貝質(zhì)粒低拷貝質(zhì)粒溫敏質(zhì)粒

測序質(zhì)粒

整合質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒表達質(zhì)粒探針質(zhì)粒pUC18

/

19：拷貝數(shù)2000-3000/cell裝有多克隆位點（MCS）顏色選擇標(biāo)記lacZ’用于基因克隆和測序GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19顏色選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理:pUC18/19PlaclacZ’MCS-半乳糖苷酶的-亞基底物：5-溴-4-氯-3-吲哚X-gal）質(zhì)粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染沸水浴法質(zhì)粒DNA純度低、快速、操作簡便堿裂解法質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間2、噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率地感染宿主細胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，在一定條件下這兩種狀態(tài)會相互轉(zhuǎn)化。3’3’CCCGCCGCTGGA

5’COS5’

TCCAGCGGCGGGGCOScosE.coli的噬菌體DNA:75-105%36

-

51

kb噬菌體的感染周期：E.coli吸附注入復(fù)制包裝裂解噬菌體的溶原狀態(tài)：（溶菌狀態(tài)）溶原狀態(tài)-DNA載體的構(gòu)建縮短野生型-DNA長度，可提高裝載量。野生型

-DNA中間40-50％的片段為生長非必需，根據(jù)切除多少，將

-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體1、縮短長度：野生型

-DNA包裝上限51kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段≤2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。插入型載體：如

gt系列。體外包裝插入位點載體長度：36

kb體外包裝插入片段0-15

kb載體長度：26

kb體外包裝插入片段插入片段大?。?0-25

kb取代型載體：2、刪除重復(fù)的酶切位點方法：3、加裝選擇標(biāo)記免疫功能類標(biāo)記：如imm434-噬菌體進入溶菌imm434基因編碼一種阻止循環(huán)的阻遏物?？蛰d體進入E.coli后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入imm434基因時，基因滅活，進入溶菌循環(huán)，形成透明斑。顏色反應(yīng)類標(biāo)記：如lacZ-DNA重組分子的體外包裝：-DNA作為載體的優(yōu)點：25

kb動植物病毒克隆載體常用的動物病毒載體：用于構(gòu)建克隆載體的植物病毒：3、cos質(zhì)粒（cosmid）25kbcos質(zhì)粒載體的特點：45

kb4、人工染色體載體將細菌接合因子或酵母染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即構(gòu)成人工染色體載體。50-300

kb350-400

kb。C

目的基因的獲得直接從染色體DNA中分離化學(xué)合成法從mRNA合成cDNAPCR法通過構(gòu)建基因文庫分離目的基因用限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，得到很多與基因大小相當(dāng)?shù)腄NA片斷，把這些片段混合物隨機插入載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，做成基因組文庫，再通過核酸分子雜交，選擇出含目的基因的DNA片斷。僅適用于原核基因的分離。1、直接從染色體DNA中分離2、化學(xué)合成法小片段粘接法：12-15

bp補釘延長法：12-15

bp20-30

bp大片段酶促法：40-50

bp采用一定方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶I（或Klenow）合成其互補DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法可得到可表達的完整基因。3、從mRNA合成cDNA雙鏈平頭cDNA使用下列方法克隆入載體：直接與載體連接；加人工接頭引入酶切位點；注意：加接頭前，先將DNA甲基化平頭兩端分別加同聚物尾。使用PCR法擴增目的基因的前提：已知目的基因全序列或兩側(cè)序列，通過合成與模板互補的上下游引物，擴增目的基因。由Taq

DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物，3’端總是帶有一個非模板依賴型的突出堿基--A，可用T載體克隆。4、PCR法擴增目的基因基因文庫（gene

library

or

gene

bank）：從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆形式存在。5、通過構(gòu)建基因文庫分離目的基因根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含全部基因）cDNA文庫（含全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）基因組文庫基因組文庫：cDNA文庫cDNA文庫：幾種載體的最大裝載量比較：基因組文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題：基因組DNA的制備：為最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，基因組DNA在分離純化操作中應(yīng)避免過度斷裂。常規(guī)方法制備的染色體DNA長度100kb左右，如先將細胞固定在低融點凝膠中，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000

kb的DNA片段?；蚪MDNA的切割：超聲波處理：DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭；部分酶切法：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！從基因文庫中篩選目的基因：根據(jù)目的基因已知核苷酸序列進行篩選根據(jù)目的基因特異性表達進行篩選根據(jù)目的基因已知核苷酸序列制備探針，對基因文庫一系列克隆子的DNA分子進行雜交，能雜交的克隆就含有目的基因，進一步對陽性克隆DNA進行測序鑒定。根據(jù)目的基因已知核苷酸序列進行篩選：根根據(jù)據(jù)目目的的基基因因特特異異性性表表達達進進行行篩篩選選：：··

·

·

····

·

·

···

·

·

·根據(jù)目的基因特異性表達進行篩選：菌落轉(zhuǎn)膜·

·

·

·菌落轉(zhuǎn)膜菌落轉(zhuǎn)膜菌落轉(zhuǎn)膜雜交雜交雜交雜交根總mRNA探針葉總mRNA探針含目的基因菌落根cDNA文庫葉cDNA文庫根cDNA文庫葉cDNA文庫陰性反應(yīng)克隆子根特異性表達的目的基因差顯雜交篩選法示意圖D

用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞受體細胞應(yīng)具備的條件實驗室常用的基因工程受體受體細胞應(yīng)具備的條件實驗室常用的基因工程受體大腸桿菌酵母菌哺乳動物細胞各種基因工程受體的特性大腸桿菌：酵母菌：哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢細胞CHO）4

基因工程的操作過程基因工程的操作過程A

DNA的體外重組（切與接）匹配粘性末端的連接EcoR

I5"G

CTTAAG5"

AATTC5"GCTTAA

5"5"G5"AATTC退火5"G

CTTAA5"AATTCGT4-DNA

ligase5"5"GAATTC

CTTAAGGAATTC

CTTAAGGCTTAA5"5"GAATTCG不同粘性末端的連接BamH

I5"5"GGATCC

CCTAGGGGATCC

CCTAGG5"GCCTAGG5"

GATCC5"CTGCA

G5"GACGTC3"T4-DNA

ligaseCGATCC

GCTAGG5"5"GGATCG

CCTAGC5"CTGCAG

GACGTC5"Pst

I3"T4-DNA

pol切平5"C

G5"GCKlenow補平5"GGATC

CCTAG5"

GATCCCTAGGGCTTAA

5"5"5"G5"

AATTCT4-DNA

ligase5"5"EcoR

I

linker5"5"T4-DNA

ligaseGCTTAA5"5"GGAATTCGG5"5"G

AATTC

CTTAA

G平末端的連接－加linkerT4-DNA

ligase5"GGATC

CCTAG5"

GATCCCTAGG5"5"TdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGGGGGGGTTAAGGATCCCCCCCCCTAG退火5"5"GGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGG平末端的連接－加同聚尾5"5"5"

GATCCccccccCTAGG5"粘性末端的更換BamH

I5"5"GGATCC

CCTAGGKlenow補平5"GATCCG5"G

CCTAG5"5"5"5"T4-DNA

ligaseGGATC

CCTAG5"GATCC

CTAGG5"5"5"EcoR

IGGATCGGAATTCCGATCC

CCTAGCCTTAAGGCTAGGGGAATTCC

CCTTAAGGEcoR

I

linkerBamH

I提高載體和外源DNA連接效率的方法：B 重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)與增）轉(zhuǎn)化細胞的擴增重組DNA分子導(dǎo)入原核細胞Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：適用于革蘭氏陰性菌（如E.coli），原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)。電穿孔轉(zhuǎn)化法：噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染：重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細胞病毒顆粒轉(zhuǎn)染法

磷酸鈣轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)法DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法聚陽離子-DMSO處理轉(zhuǎn)染法顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)病毒顆粒轉(zhuǎn)染法:磷酸鈣轉(zhuǎn)染法：DNA-磷酸鈣哺乳動物細胞能捕獲粘附在細胞表面的沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細胞。先將待轉(zhuǎn)染的重組DNA同CaCl2混合，隨后緩慢加入Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣沉淀，粘附在培養(yǎng)的細胞表面，達到轉(zhuǎn)染目的。脂質(zhì)體介導(dǎo)法:重組DNA分子導(dǎo)入植物細胞影響轉(zhuǎn)化效率的因素：載體及DNA重組分子方面：載體本身的性質(zhì)：載體的空間構(gòu)象：插入片段的大?。菏荏w細胞方面：轉(zhuǎn)化方法方面：受體細胞的預(yù)處理：供受體的比例：轉(zhuǎn)化方法：轉(zhuǎn)化細胞的擴增C

轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）根據(jù)載體標(biāo)記篩選：抗藥性篩選法：ROPROISal

IBamH

ITcrPvu

IPst

IPst

IEcoR

ICla

IHind

IIIHind

IIBal

IAp

rpBR3224363

bpori將外源DNA片段插入BamHI、Sal

I位點：非重組子：Apr、Tcr重組子：Apr、Tcs先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上在Ap平板上生長、但在Ap+Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子為重組子ApAp+Tc影印挑選操作：顯色篩選法：載體分子上攜帶顏色反應(yīng)標(biāo)記，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應(yīng)）。lacZ"基本操作：目的基因序列檢測：限制性酶切圖譜法DNA雜交法PCR法DNA序列測定1、限制性酶切圖譜法：pUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’ori用BamH

I酶切：重組子：2.7

kb+4.0

kb空載體：2.7

kb如外源DNA片段也是2.7

kb，可用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，通過其長度來鑒定是否為重組子。pUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’oriEcoR

IPst

IpUC182.7

kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’ori4

kSph

IHind

IIIEcoR

I2、DNA雜交法：雜交探針的制備：探針必須滿足下列條件：單鏈結(jié)構(gòu)（雙鏈DNA可用堿變性）足夠長度（至少12

bp）內(nèi)部不含互補區(qū)探針的制備方法和來源：人工合成cDNA合成雜交探針標(biāo)記方法：DNA

pol

I

介導(dǎo)的缺口前移標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記T4-PNP介導(dǎo)的末端標(biāo)記ABC熒光標(biāo)記ABC顯色酶標(biāo)記地高辛系統(tǒng)標(biāo)記1）DNA聚合酶介導(dǎo)的缺口前移標(biāo)記:Mg2+5‘

dNTP5‘

ppp

dA（

-32P-