臍帶血造血干細(xì)胞分離凍存方法的比較

臍帶血造血干細(xì)胞分離凍存方法的比較

肚臍出血的原始細(xì)胞是具有分解潛力的倫理c。它具有自我更新和復(fù)制能力，能夠在某些因素的影響或誘導(dǎo)下分裂各種細(xì)胞和組織。臍帶血造血干細(xì)胞移植能修復(fù)患者造血機能和免疫功能,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于惡性血液病、自身免疫性疾病、嚴(yán)重免疫缺陷癥的臨床治療1試驗材料和方法1.1試劑和儀器按照美國臍帶血庫標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程無菌采集健康、足月分娩產(chǎn)婦的臍帶血,采集后24h內(nèi)處理。所用主要試劑和設(shè)備有:DMSO購自Sigma公司;6%羥乙基淀粉生理鹽水注射液購自B.BRAUNMedical公司;10%右旋糖酐40生理鹽水注射液購自Hospira公司;胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基及F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Gibco公司;CD34、CD45抗體購自BeckmanCoulter公司;臺盼藍(lán)試劑盒購自碧云天公司;甲基纖維素培養(yǎng)基購自美天旎公司;血細(xì)胞分析儀KX-21N購自希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司;生物安全柜HFsafe1200A2購自力新儀器(上海)有限公司;大容量低溫冷凍離心機J6-MI購自BeckmanCoulter公司;程控降溫儀GDKRY0750PLUS購自BritainPlaner公司。1.2測試方法1.2.1富紅細(xì)胞血漿的制備利用離心沉降法和自然沉降法分離臍帶血有核細(xì)胞,計算有核細(xì)胞回收率和紅細(xì)胞回收率,比較兩種分離方法的分離效果。離心沉降法:將6%的羥乙基淀粉注射液和臍帶血按照1∶5的比例混合,慢速搖勻10min,以50g、10℃離心7min,收集上層富白細(xì)胞血漿,再以400g、10℃離心15min,去除血漿。自然沉降法:將6%的羥乙基淀粉注射液和臍帶血按照1:5的比例混合,慢速搖勻10min,懸掛讓其內(nèi)細(xì)胞自然沉降1h后,收集上層富白細(xì)胞血漿,同樣以400g、10℃離心15min,去除血漿。1.2.2冷凍保護劑將分離后的臍帶血分別與4種不同的冷凍保護劑混合,臍帶血與冷凍保護劑的體積比為4∶1,混合時應(yīng)將冷凍保護劑緩慢注入臍帶血中,邊注入邊晃動。用程控降溫儀按以下程序降溫,4℃保持10min,以-1℃/min的速率降溫至-40℃,再以-10℃/min的速率降溫至-80℃,完成后將臍帶血混合物放入液氮罐中儲存。4種冷凍保護劑分別為:DMSO和0.9%氯化鈉溶液1∶1混合液,DMSO和6%右旋糖酐1∶1混合液,DMSO和6%羥乙基淀粉1∶1混合液,DMSO、胎牛血清和F12培養(yǎng)基9∶4∶5混合液。冷凍保護劑新鮮配制并于4℃提前預(yù)冷。1.2.3不同冷凍保護劑對凍存效果的影響臍帶血凍存3個月后,將凍存的臍帶血在37℃水浴鍋中復(fù)蘇,測細(xì)胞存活率,用流式細(xì)胞儀進行造血干細(xì)胞表面標(biāo)志等分析,并進行祖細(xì)胞集落培養(yǎng),從而比較4種冷凍保護劑的凍存效果的差異性。1.2.4細(xì)胞總體重懸液取100μL臍帶血樣品,加入900μL氯化銨溶血素,4℃避光反應(yīng)5min,200g離心5min,棄上清加入細(xì)胞重懸液900μL重懸,再取50μL混合液加入臺盼藍(lán)2X溶液50μL,靜置3min后計數(shù)。每個樣品至少數(shù)300個細(xì)胞,計算有核細(xì)胞存活率。1.2.5流式細(xì)胞儀的檢測計數(shù)CD341.2.6祖細(xì)胞聚集和培養(yǎng)集落形成分析是一種檢驗造血干祖細(xì)胞活性公認(rèn)的敏感方法1.2.7不同試劑的凍存效果選擇上述研究中最佳冷凍保護劑,采用相同的試劑和方法,比較同一份臍帶血樣本凍存前、凍存3個月、6個月和一年的存活率、有核細(xì)胞數(shù)、CD341.2.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,測定結(jié)果均按平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計學(xué)處理采用區(qū)組設(shè)計的方差分析,顯著性水平為P<0.05。2試驗結(jié)果2.1自然沉降法離心沉降法有核細(xì)胞回收率為83.60%±9.44%,自然沉降法有核細(xì)胞回收率為86.40%±8.49%,二者之間差異無顯著性意義(P>0.05),但離心沉降法所需時間更短,操作簡便,更適合臍帶血庫。2.2各組細(xì)胞回收率的比較4種凍存液凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后有核細(xì)胞回收率和存活率結(jié)果見表1。結(jié)果表明:第4種冷凍保護劑凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后有核細(xì)胞回收率與前3種的差異有極顯著意義(P<0.01),且數(shù)據(jù)偏低不能達(dá)到要求;第1,2,3種冷凍保護劑復(fù)蘇有核細(xì)胞回收率的差異無顯著意義(P>0.05);4種冷凍保護劑復(fù)蘇細(xì)胞存活率的差異有極顯著意義(P<0.01),其中第2種和第3種差異不顯著,復(fù)蘇后存活率最佳。2.3恢復(fù)后流的分析與祖細(xì)胞培養(yǎng)4種冷凍保護劑凍存的細(xì)胞復(fù)蘇流式分析和祖細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果見表2。4種冷凍保護劑冷凍的細(xì)胞復(fù)蘇CD342.4護劑dmso+6%羥乙基淀粉的制備根據(jù)以上研究結(jié)果,選擇效果最佳的冷凍保護劑DMSO+6%羥乙基淀粉作為研究對象。將同一份臍帶血凍存前、凍存3個月、6個月和12個月的存活率、有核細(xì)胞數(shù)、CD343凍存方法和冷凍保護劑對空間生長的影響臍帶血是胎兒娩出斷臍后殘留在胎盤和臍帶中的血液,通常是廢棄不用的。研究發(fā)現(xiàn),臍帶血中含有可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干細(xì)胞,可用于造血干細(xì)胞移植,同時臍帶血較骨髓和外周血相比有來源廣泛、采集簡便快捷、HLA相容性要求低、成本低廉等優(yōu)點有文獻(xiàn)證明,CD34分離臍帶血造血干細(xì)胞方法常采用分選法、羥乙基淀粉沉淀法和密度梯度離心法臍帶血造血干細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程會引起細(xì)胞內(nèi)水分形成冰晶及細(xì)胞內(nèi)滲透壓的改變,這會導(dǎo)致干細(xì)胞損傷,活力會有一定下降,但選擇好的凍存方法和冷凍保護劑可使臍帶血造血干細(xì)胞活力得到較好的保存。臍帶血造血干細(xì)胞的凍存方法較多,目的是盡量減小凍存后對細(xì)胞的損傷,目前多選擇程序降溫或者-80℃冰箱降溫后液氮保存的方法。在進行凍存時選擇程序降溫法,相比于非程序降溫法雖然總CD34+細(xì)胞數(shù)和