克氏梭菌硫解酶3個(gè)編碼基因的克隆與表達(dá)分析

克氏梭菌硫解酶3個(gè)編碼基因的克隆與表達(dá)分析

正己酸是一種含有六個(gè)碳的直鏈脂肪酸，具有杏仁的味道。它自然存在于動(dòng)物脂肪、酒精、贊助者和蔬菜中。己酸及其酯類因具有特殊的風(fēng)味,被廣泛用于食品和香精行業(yè),是重要的食品添加劑。己酸還具有抑制病原菌、改善腸道微生物菌群、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和增強(qiáng)動(dòng)物免疫的作用,可替代部分抗生素的使用,其在動(dòng)物養(yǎng)殖方面得到越來(lái)越多的研究和應(yīng)用當(dāng)前己酸主要通過(guò)化學(xué)合成,傳統(tǒng)工藝采用硝酸氧化仲辛醇進(jìn)行制備,該方法轉(zhuǎn)化率較高、成本低廉,但也存在選擇性不佳、環(huán)境污染較嚴(yán)重等問(wèn)題目前已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)己酸微生物菌株有克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)目前的研究表明,細(xì)菌合成己酸和丁酸主要通過(guò)逆向β-氧化(reversaloftheβ-oxidation)途徑進(jìn)行,該途徑被用于碳鏈的延長(zhǎng)。以丁酸的合成為例,該途徑的酶系包括硫解酶(Thl:thiolase,又稱乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶)、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶(Hbd:3-hydroxybutyryl-CoAdehydrogenase)、3-羥基丁酰輔酶A脫水酶(Crt:3-hydroxybutyryl-CoAdehydratase)、丁酰輔酶A脫氫酶復(fù)合物(Bcd/EtfAB:butyryl-CoAdehydrogenasecomplex)、輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Cat:CoAtransferases)。硫解酶催化了逆向β-氧化合成的第一步反應(yīng),即將?；o酶A與乙酰輔酶A進(jìn)行縮合,形成一分子3-酮?；o酶A,延長(zhǎng)一個(gè)二碳單位,圖1為基于酶促反應(yīng)推導(dǎo)的克氏梭菌合成丁酸和己酸的代謝途徑?？耸纤缶哂?個(gè)硫解酶編碼基因(thlA1,CKL_3696;thlA2,CKL_3697;thlA3,CKL_3698),多于其他產(chǎn)酸梭菌(丙酮丁醇梭菌2個(gè),拜式梭菌2個(gè),丁酸梭菌2個(gè),酪丁酸梭菌1個(gè))。序列比對(duì)分析表明ThlA2與ThlA3蛋白序列同一性(identity)為90%,ThlA1與ThlA2/ThlA3的同一性為81%,這3個(gè)硫解酶與丙酮丁醇梭菌硫解酶的蛋白同一性在75%以上(圖2)?？梢?jiàn)克氏梭菌3個(gè)硫解酶高度同源,且與丁酸合成菌株的硫解酶在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)水平具有顯著區(qū)別。從基因組織結(jié)構(gòu)上來(lái)看,克氏梭菌3個(gè)硫解酶編碼基因thlA1、thlA2和thlA3的編碼方向一致,3個(gè)基因上游非翻譯區(qū)(5′UTR)長(zhǎng)度分別為880、796、182bp,這3個(gè)基因存在分別轉(zhuǎn)錄的可能性(圖2)。雖然硫解酶在梭菌綱微生物中較為常見(jiàn),大部分梭菌合成丁酸的效率較高,但合成己酸的梭菌并不多見(jiàn),因此我們推測(cè)克氏梭菌中的硫解酶具有不同于丁酸合成菌硫解酶的底物催化能力。這3個(gè)硫解酶是否在己酸合成過(guò)程中均發(fā)揮功能,以及是否具有不同的底物特異性尚不清晰。本文首先對(duì)克氏梭菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)克氏梭菌以己酸為主要代謝產(chǎn)物,合成少量的丁酸和微量的辛酸。雖然克氏梭菌3個(gè)硫解酶編碼基因高度同源,但轉(zhuǎn)錄分析表明3個(gè)硫解酶編碼基因具有不同的表達(dá)水平和時(shí)序表達(dá)特征。隨后進(jìn)行的硫解酶酶動(dòng)力學(xué)分析表明克氏梭菌3個(gè)硫解酶對(duì)于四碳底物均顯示出相似的底物親和力(K1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇和顆粒1.1.2熒光定量pcr檢測(cè)TrizoltotalRNAextractionkitRNA提取試劑盒(Lifetechnologies,美國(guó)),PrimeScriptRTreagentkitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,大連),SYBRPremixExTaq?II(TliRNaseHPlus)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa,大連)。氣相色譜儀-FID7890B(Agilent,美國(guó)),NanoDrop8000蛋白核酸測(cè)定分光光度計(jì)(ThermoFisherScientific,美國(guó)),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(AppliedBiosystems,美國(guó))。1.1.3基本培訓(xùn)(1)改良乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基(g/L)1.2培養(yǎng)液用量的確定克氏梭菌在37°C的厭氧培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),以乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基?？耸纤缶l(fā)酵方法為:從平板上挑取單菌落接入5mL一級(jí)種子培養(yǎng)基中,培養(yǎng)約24h后按10%(V/V)接種量接種入二級(jí)種子培養(yǎng)基中,約24h后按照10%(V/V)接種量轉(zhuǎn)接種入30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,每隔12h進(jìn)行取樣,用于底物和產(chǎn)物分析。大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行好氧培養(yǎng),以卡那霉素(50uf06dg/mL)和氯霉素(25uf06dg/mL)進(jìn)行篩選。1.3總rna的制備發(fā)酵體積為2000mL,分別在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期(E)、中期(M)、轉(zhuǎn)換期(T)和穩(wěn)定期(S)收集菌液,8000r/min,4°C離心10min,去除上清收集菌體凍存于液氮中。取大約0.1g菌體置于研缽中,在液氮保護(hù)下,將菌體研磨成白色粉末狀,迅速分裝至裝有1.0mLTrizol試劑的1.5mL離心管中,振蕩迅速混勻(放入菌體粉末前確認(rèn)液氮已完全揮發(fā))。加入200μL的氯仿,以異丙醇沉淀法,按照Trizol試劑使用說(shuō)明書(shū)提取總RNA。RNA濃度由NanoDrop8000檢測(cè),完整性經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.4rna-seq測(cè)序分別收集克氏梭菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期(E)、中期(M)、轉(zhuǎn)換期(T)和穩(wěn)定期(S)的4個(gè)階段的菌體,將菌體研磨成白色粉末狀,迅速分裝至裝有1.0mLTrizol試劑的1.5mL離心管中。將樣品存儲(chǔ)在干冰中送至北京百邁克生物科技有限公司完成RNA-Seq測(cè)序。RNA樣品的檢測(cè)分別采用Nanodrop、Qubit2.0、Agilent2100、電泳方法,檢測(cè)RNA樣品的純度、濃度、完整性。樣品檢測(cè)合格后,進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。測(cè)序平臺(tái)為IlluminaHiSeq2500。對(duì)RawData進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾,去除其中的接頭序列及低質(zhì)量reads獲得高質(zhì)量的CleanData。將CleanData與克氏梭菌DSM555的全基因組進(jìn)行序列比對(duì),獲得MappedData。采用RPKM1.5反轉(zhuǎn)錄-熒光定量pcr按照試劑盒(PrimeScriptRTreagentkitwithgDNAEraser)說(shuō)明書(shū)的操作指南,取0.5μgRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄前先加入gDNAEraser去除基因組DNA污染),反轉(zhuǎn)錄體系20μL。以cDNA為模板,使用基因特異性引物,采用反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR檢測(cè)3個(gè)硫解酶編碼基因在不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平,以16SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因,所用引物序列見(jiàn)表3。由于克氏梭菌3個(gè)硫解酶編碼基因序列高度相似,所用引物的特異性經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR反應(yīng)體系(10μL):SYBRPremixExTaqII5μL,上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL,模板2.5μL(反轉(zhuǎn)錄cDNA在使用前進(jìn)行稀釋,檢測(cè)硫解酶基因進(jìn)行50倍稀釋,檢測(cè)16SrRNA基因進(jìn)行5000倍稀釋),超純水1.5μL。PCR條件:95°C預(yù)變性1min;循環(huán)擴(kuò)增條件為95°C10s,55°C30s,72°C30s。1.6硫酸酶編碼基因的克隆和e.coli表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)克氏梭菌和丙酮丁醇梭菌的硫解酶編碼基因序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增thlA1、thlA2、thlA3、thlA1.7u3000酸酶液的純化及酶濃度的測(cè)定在4°C、10000r/min條件下離心10min收集菌體,將細(xì)胞重懸于冰浴預(yù)冷的緩沖液A(20mmol/LTris-HCl,pH8.0,5mmol/Luf062-巰基乙醇和150mmol/LNaCl),細(xì)胞經(jīng)超聲破碎,細(xì)胞裂解液經(jīng)4°C、10000r/min離心1h去除碎片。離心后的粗酶液經(jīng)0.22uf06dm微孔濾膜過(guò)濾后與Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen)結(jié)合。硫解酶蛋白經(jīng)緩沖液B(20mmol/LTris-HCl,pH8.0,5mmol/Luf062-巰基乙醇,500mmol/L咪唑和150mmol/LNaCl)線性洗脫,洗脫所用咪唑濃度為500mmol/L。純化蛋白用超濾管(截留分子量大小10kDa)濃縮,蛋白儲(chǔ)存的緩沖液(20mmol/LTris-HCl,pH8.0,1mmol/LDTT,150mmol/LNaCl)洗脫2次。取5uf06dL酶液加200uf06dL考馬斯亮藍(lán)溶液,室溫反應(yīng)3min后,酶標(biāo)儀測(cè)定595nm波長(zhǎng)下吸光值,將測(cè)定的吸光值帶入蛋白濃度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算酶濃度。將4個(gè)酶稀釋到相同濃度后,分裝凍存于–80°C。1.8硫酸酶動(dòng)態(tài)參數(shù)的測(cè)定反應(yīng)條件為100mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LDTT,10mmol/LMgCl1.9發(fā)酵菌種的檢測(cè)克氏梭菌種子液按10%接種量接種入乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中,于37°C靜置厭氧培養(yǎng),每隔12h取樣。底物(乙醇和乙酸)和產(chǎn)物(丁酸、己酸和辛酸)用氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)器(GC-FID)進(jìn)行檢測(cè)。樣品處理方法為:取1mL發(fā)酵液進(jìn)行高速離心,取200uf06dL上清液,加入50uf06dL內(nèi)標(biāo)液(pH2.2,含12.5g/L叔戊酸),再加入250uf06dL乙醚作為萃取劑,渦旋振蕩30s,高速離心2min,取上清立即進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為AgilentCP-Wax57CB,進(jìn)樣口溫度220°C,檢測(cè)器溫度220°C,載氣氮?dú)饬魉?5mL/min,氫氣流速40mL/min,空氣流速450mL/min,進(jìn)樣量1μL,分流比30∶1。程序升溫:60°C保持0.5min,20°C/min升溫到190°C,保持4.5min。2結(jié)果和分析2.1丁酸、己酸和硫酸摩爾比克氏梭菌以乙醇和乙酸為底物,本研究中發(fā)酵初始時(shí)刻的乙醇和乙酸根濃度分別為325mmol/L(15g/L)和50mmol/L(3g/L)。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí),利用的乙醇與乙酸根摩爾比為2.6∶1.0;丁酸、己酸和辛酸終濃度分別為3.52mmol/L(0.31g/L)、45.71mmol/L(5.31g/L)和1.11mmol/L(0.16g/L),丁酸、己酸和辛酸摩爾比為3∶41∶1,質(zhì)量比為2∶33∶1(圖3)。在此培養(yǎng)條件下,克氏梭菌的主要代謝產(chǎn)物為己酸,僅合成少量的丁酸和微量的辛酸?；诳耸纤缶核岚l(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征,我們推測(cè)克氏梭菌的短中鏈脂肪酸合成酶系傾向于催化四碳和六碳產(chǎn)物的形成。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析還表明,丁酸呈現(xiàn)出先合成再被利用的特征。丁酸之所以能被回用,推測(cè)存在兩種可能性:(1)輔酶A轉(zhuǎn)移酶(Cat)具有較為廣泛的底物特異性當(dāng)以乙醇和丁酸根作為碳源時(shí),克氏梭菌產(chǎn)生己酸和微量的辛酸,丁酸呈現(xiàn)出凈消耗,無(wú)乙酸被檢測(cè)到(圖4)?？梢?jiàn),當(dāng)乙酸存在時(shí)克氏梭菌可合成己酸和丁酸,無(wú)乙酸而添加丁酸時(shí)合成己酸。根據(jù)克氏梭菌的己酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征(圖3,圖4)和丁酸、己酸合成途徑(圖1),我們推測(cè)克氏梭菌硫解酶同時(shí)具有催化丁酸合成和己酸合成的能力,硫解酶的體內(nèi)催化功能可能受到初始碳源種類的調(diào)控。2.2硫解酶編碼基因表達(dá)水平以上發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析表明,當(dāng)以乙醇和乙酸作為主要碳源時(shí),克氏梭菌傾向于己酸和丁酸的合成,故克氏梭菌硫解酶可以同時(shí)催化己酸和丁酸的合成。為研究克氏梭菌3個(gè)硫解酶編碼基因的表達(dá)特征,我們對(duì)丁酸快速累積階段(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期,E)、己酸快速累積階段(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期,M)、丁酸回用階段(生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換期,T)和乙酸完全消耗階段(生長(zhǎng)穩(wěn)定期,S)4個(gè)關(guān)鍵發(fā)酵階段的硫解酶編碼基因的表達(dá)水平和時(shí)序表達(dá)特征分析。RNA-Seq測(cè)定了3955個(gè)基因表達(dá)水平,3個(gè)硫解酶編碼基因的最高表達(dá)水平(RPKM值的大小)分別位列第4、23和14位。thlA1、thlA2和thlA3表達(dá)的最高RPKM值分別為32303(E期)、9331(T期)和14037(E期)(圖5-A、C、E)。值得注意的是,雖然RNA-Seq顯示出thlA1在各時(shí)期的表達(dá)量均遠(yuǎn)高于thlA2和thlA3,但后兩者的表達(dá)水平仍然相當(dāng)可觀。盡管3個(gè)硫解酶高度同源,但卻具有不同的表達(dá)水平和時(shí)序表達(dá)特征。在生長(zhǎng)穩(wěn)定期(S)之前,thlA1基因維持恒定表達(dá),thlA2基因表達(dá)時(shí)序上調(diào),thlA3基因表達(dá)時(shí)序下調(diào)(圖5)。此外,在S期,3個(gè)硫解酶編碼基因的表達(dá)均大幅度下調(diào)。對(duì)比底物利用情況(圖3-B),在S期,雖然具有大量未被利用的乙醇,但乙酸已經(jīng)降低到較低水平,且該時(shí)刻菌體不再生長(zhǎng),即將進(jìn)入衰亡期?？梢?jiàn),3個(gè)硫解酶編碼基因的表達(dá)嚴(yán)格依賴于菌體生長(zhǎng),推測(cè)這3個(gè)基因是菌體維持生長(zhǎng)所必需的基因,當(dāng)菌體衰亡或碳源相對(duì)缺乏時(shí)(克氏梭菌無(wú)法單獨(dú)以乙醇為碳源生長(zhǎng)),3個(gè)硫解酶無(wú)法維持高水平表達(dá)。2.3克氏梭菌對(duì)3-酮基己酰氧化酶a的合成從克氏梭菌和丙酮丁醇梭菌基因組DNA擴(kuò)增4個(gè)硫解酶編碼基因,在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá),通過(guò)His-tag標(biāo)簽親和層析獲得目的酶蛋白(圖6)。硫解酶在梭菌菌體內(nèi)傾向于合成方向的催化反應(yīng),克氏梭菌合成乙酰乙酰輔酶A和3-酮基己酰輔酶A的反應(yīng)方程式(方程式1-2)上述生化反應(yīng)顯示,乙酰輔酶A的乙?；贿B接到?；o酶A的β碳原子上,形成增加了1個(gè)二碳單位的3-酮基-?；o酶A,ΔG>0,正向反應(yīng)在熱力學(xué)上不可行,體外測(cè)定硫解酶的底物親和力時(shí)通常測(cè)定其在降解方向上的酶活力以不同濃度的乙酰乙酰輔酶A和50uf06dmol/L輔酶A為底物,測(cè)定克氏梭菌來(lái)源的3個(gè)硫解酶和丙酮丁醇梭菌來(lái)源的硫解酶ThlA3克氏梭菌硫解酶編碼基因?qū)τ陂L(zhǎng)鏈脂肪酸合成,?；d體蛋白(ACP)被用作?；暮铣善脚_(tái),而對(duì)于C4–C10的短中鏈脂肪酸合成,輔酶A通常被用作?；d體克氏梭菌具有在微生物中鮮有的C6脂肪鏈合成酶系,而硫解酶是催化六碳鏈合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶。體外純化的硫解酶傾向于催化硫酯鍵斷裂,而在微生物體內(nèi),由于下游反應(yīng)的拉動(dòng),使體內(nèi)表達(dá)出的硫解酶更傾向于硫酯鍵合成方向的反應(yīng)。己酸合成反應(yīng)途徑中,碳六產(chǎn)物形成的關(guān)鍵步驟為在硫解酶催化下乙酰輔酶A與丁酰輔酶A進(jìn)行縮合反應(yīng),生成3-酮基己酰輔酶A(碳六骨架),該過(guò)程也會(huì)生成一定量的乙酰乙酰輔酶A(3-酮基丁酰輔酶A,碳四骨架)。當(dāng)以乙醇和乙酸鹽作為碳源時(shí),終端代謝產(chǎn)物主要為己酸和丁酸;而以乙醇和丁酸作為碳源時(shí),終端代謝產(chǎn)物主要為己酸,丁酸為凈消耗。本研究中發(fā)現(xiàn)克氏梭菌硫解酶的表達(dá)量非常高,3-酮?；o酶A在胞內(nèi)的存在時(shí)間可能較短,3-酮?；o酶A胞內(nèi)濃度可能受到底物類型的控制。當(dāng)乙醇和乙酸鹽作為碳源時(shí),胞內(nèi)的輔酶A可能主要以乙酰輔酶A的形式存在,丁酰輔酶A/乙酰輔酶A比值較低,硫解酶可以同時(shí)催化合成乙酰乙酰輔酶A和3-酮基己酰輔酶A;而當(dāng)以乙醇和丁酸鹽作為碳源