亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦成蝦的急性毒性試驗(yàn)

亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦成蝦的急性毒性試驗(yàn)

在水產(chǎn)動(dòng)物的飼養(yǎng)中，尤其是在高密度養(yǎng)殖的模式下，人工將大量協(xié)助飼料用于水體。水中的有機(jī)代謝廢物大量積聚，尤其是亞硝酸鹽濃度正在逐漸增加，這往往會(huì)導(dǎo)致水生動(dòng)物的異常生活。它的毒性影響動(dòng)物的生存、生長(zhǎng)和發(fā)育，是引起疾病的主要因素。國內(nèi)外許多學(xué)者研究了亞硝酸鹽對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的急性毒性效應(yīng),進(jìn)行了病理學(xué)研究并探討了其中毒機(jī)理克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱淡水小龍蝦,分類學(xué)上屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱軟甲亞綱十足目螯蝦亞目蜊蛄科原螯蝦屬,原產(chǎn)北美洲,20世紀(jì)30年代末由日本傳入我國。由于其因肉味鮮美,適應(yīng)性廣、繁殖力強(qiáng),能適應(yīng)稻田、池塘、灘地等多種水域養(yǎng)殖,已成為我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蝦類,是目前我國水產(chǎn)業(yè)中發(fā)展最為迅速、最具特色、最有潛力的養(yǎng)殖品種之一。目前對(duì)克氏原螯蝦的研究主要集中在繁殖生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)生理、基礎(chǔ)代謝、重金屬污染等方面1材料和方法1.1試驗(yàn)用蝦的選擇試驗(yàn)用克氏原螫蝦體重為(9.32±1.57)g,體長(zhǎng)為(6.91±0.41)cm,取自山東省東平縣第一淡水養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng),在室內(nèi)暫養(yǎng)7d。暫養(yǎng)和試驗(yàn)容器均為裝有20L水的塑料水族箱(57cm×40cm×34cm),試驗(yàn)前24h停食,并從中選擇體質(zhì)健壯、體色一致、活動(dòng)性強(qiáng)和附肢完整的成蝦作為試驗(yàn)用蝦。試驗(yàn)在山東省淡水漁業(yè)研究院國家級(jí)水產(chǎn)良種場(chǎng)溫室中進(jìn)行,試驗(yàn)水源為玉景礦泉水廠700m深井水,其水質(zhì)指標(biāo)如下:水溫(20.9±2.9)℃,pH7.86,DO(5.24±0.63)mg/L,溶解性總固體(TDS)(0.44±0.05)mg/L;NH1.2不同濃度亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的影響(1)亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性試驗(yàn)經(jīng)預(yù)備試驗(yàn),確定各組藥物質(zhì)量濃度范圍(96h全活質(zhì)量濃度上限和24h全部致死質(zhì)量濃度下限)后,在室溫條件下,采用半靜水停食實(shí)驗(yàn)法,按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置7個(gè)質(zhì)量濃度梯度組(16.00、24.11、36.32、54.72、82.44、124.20mg/L和187.12mg/L)和1個(gè)清水對(duì)照組,每組3個(gè)平行,為保證試驗(yàn)期間藥物濃度的穩(wěn)定,每24h全部換液1次。試驗(yàn)開始的前10h連續(xù)觀察,及時(shí)取出死亡成蝦并排污,記錄24、48、72、96h各組蝦的癥狀及死亡數(shù)。其死亡的個(gè)體以鑷子碰觸蝦體腹部完全無反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,參照譚蘋式中,24hLC(2)亞硝酸鹽對(duì)克氏原螯蝦抗病因子影響試驗(yàn)脅迫濃度在安全濃度(12.32mg/L)基礎(chǔ)上設(shè)置為12mg/L亞硝酸鹽氮濃度組和0mg/L對(duì)照組。準(zhǔn)確稱取亞硝酸鈉放入裝有20L水的塑料水族箱(57cm×40cm×34cm)溶解完全后,每試驗(yàn)組隨機(jī)放入活性旺盛的克氏原螯蝦20只,每平行重復(fù)2組。持續(xù)充氣,每24h更換試驗(yàn)溶液1次以維持藥物濃度。于脅迫后12、24、48、60h和72h分別從試驗(yàn)組和對(duì)照組隨機(jī)取出3只蝦,在冰上迅速采集肝胰腺組織樣品,分別加9倍質(zhì)量0.85%預(yù)冷無菌生理鹽水制備成10%的組織勻漿,在冰浴條件下進(jìn)行勻漿。勻漿液經(jīng)3000r/min4℃離心15min,吸取上清液于潔凈的離心管中-20℃保存?zhèn)溆?。采用南京建成生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒分別測(cè)定肝胰腺的氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活性,測(cè)定方法按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。每個(gè)樣品重復(fù)2次。T-SOD定義為每毫克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活性單位(U/mgProt);組織中CAT以1mg蛋白1s分解1μmol的H脅迫影響的相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件處理,并采用雙尾t檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,以P≤0.05作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果與分析2.1蝦已試驗(yàn)從1h后至12h后,蝦已通過外來血藥向使用,在半小蝦上出現(xiàn)異常試驗(yàn)初期,試驗(yàn)組克氏原螯蝦活動(dòng)狀況與對(duì)照組基本相似,都散落在箱體底部緩慢爬動(dòng),碰觸后反應(yīng)敏捷。隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng),克氏原螯蝦在不同試驗(yàn)組中出現(xiàn)不同程度的游動(dòng)加劇、上下串游、游動(dòng)遲緩等不安狀況。試驗(yàn)開始5h后,124.20mg/L和187.12mg/L濃度組出現(xiàn)中毒癥狀,部分成蝦急躁不安,沿箱壁快速游動(dòng)。7h后行動(dòng)減緩,不時(shí)側(cè)游、側(cè)翻,游泳足擺動(dòng)緩慢,若受觸動(dòng),能迅速逃游,但片刻后又側(cè)翻、側(cè)游,有部分蝦腹部朝上彎曲,反應(yīng)遲鈍。10h后187.12mg/L組平均已有4尾身體彎曲,體色變暗,活動(dòng)微弱,若受驚,已不能逃游,呈昏迷狀態(tài),沉入水底不動(dòng)。24h后死亡成蝦體色變暗,頭胸部與腹部有明顯的分節(jié)。表1為亞硝酸鹽氮對(duì)克氏原螯蝦成蝦的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果。在一定試驗(yàn)時(shí)間內(nèi),隨著NO2.2t-sod和肝胰腺cat活性水體中亞硝酸鹽氮在安全濃度內(nèi)對(duì)克氏原螯蝦成蝦肝胰腺抗氧化酶類活性影響如圖1所示。對(duì)照組肝胰腺T-SOD活性在60h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,呈小幅波動(dòng),差異不顯著(P>0.05),隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng),在72h時(shí)顯著降低至(15.24±2.99)U/mgProt;在12mg/LNO對(duì)照組肝胰腺CAT活性在72h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,呈小幅波動(dòng),差異不顯著(P>0.05);在12mg/LNO2.3亞硝酸鹽氮對(duì)肝臟原生動(dòng)物肝功能的影響水體中亞硝酸鹽氮在安全濃度內(nèi)對(duì)克氏原螯蝦成蝦肝胰腺酸、堿磷酸酶活性的影響如圖2所示。圖2顯示:整個(gè)試驗(yàn)過程中,在12mg/LNO3頭胸部與肢體的安全質(zhì)量濃度sc亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中重要的污染物,是導(dǎo)致甲殼動(dòng)物免疫能力降低、疾病發(fā)生的重要因素,可引起機(jī)體生理生化因子及組織結(jié)構(gòu)的改變,并能改變與免疫抗病能力有關(guān)酶類的活性。在試驗(yàn)過程中,中毒克氏原螯蝦先表現(xiàn)為游動(dòng)加劇,后動(dòng)作遲緩;死亡個(gè)體體色變暗,頭胸部與腹部有明顯的分節(jié)。其安全質(zhì)量濃度(SC)為12.32mg/L,是幼蝦亞硝酸鹽中毒組織病變最嚴(yán)重的器官是肝胰腺在甲殼動(dòng)物的免疫體系中,ACP和AKP均為磷酸單酯酶,主要分布在肝胰腺、血淋巴中,是甲殼動(dòng)物溶酶體酶的重要組成成分,在免疫應(yīng)答中起重要的作用。肝胰腺作為重要的解毒器官和脂肪代謝場(chǎng)所,其中具有水解酶作用的ACP含量較為豐富,因而ACP活力