高效液相色譜質(zhì)譜lc-msms法測定血漿中色瑞替尼濃度的不確定度評定

高效液相色譜質(zhì)譜lc-msms法測定血漿中色瑞替尼濃度的不確定度評定

不確定度是指由于測量誤差的存在，無法確定測量值的程度，即測量值的分散，這是測量值的合理分配。材料和方法1標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)格色瑞替尼對照品(批號:160711;規(guī)格:100mg;純度:>99%;北京世康合成醫(yī)藥科技有限公司提供),內(nèi)標(biāo)依魯替尼(批號:150701;規(guī)格:10mg;純度:99.34%;中國食品藥品檢定研究院提供)。甲醇和乙腈(色譜純,美國FisherScientific生產(chǎn));甲酸(色譜純,批號:14112,迪馬有限公司生產(chǎn))。超純水(18.2MΩ·cm,25℃)為德國Milli-Q純水系統(tǒng)制備;空白小鼠血漿(配制含藥血漿)。2進(jìn)樣器、脫氣力LC20ADXR液相色譜儀(配有自動進(jìn)樣器、脫氣機(jī)等,日本SHIMADZU公司);QTRAP5500質(zhì)譜檢測儀、Analyst3度洗脫試驗(yàn)流動相為乙腈(A)和水(B)(兩者均含0.1%甲酸),采用梯度洗脫的方式(0~0.1min,95%B;0.1~0.6min,95%B;0.6~1.3min,5%B;1.3~3.3min,0%B;3.3~4.5min,95%B),流速0.7mL·min4多反應(yīng)監(jiān)測模式采用大氣壓電噴霧離子源(ESI),多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),正離子掃描,噴霧電壓5500V,溫度550℃,GS1為55.0L·min5濃度的配制方法精密稱取10.01mg的色瑞替尼對照品于10mL燒杯中,加入少量乙腈溶解后轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中,定容得到濃度為1mg·mL精密稱取依魯替尼對照品5mg于50mL燒杯中,以少量乙腈溶解后轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中,定容得到濃度為100μg·mL采用移液器(量程范圍為20~200μL)分別吸取50μL系列濃度的色瑞替尼工作液(L-1至L-6)于Eppendorf管中,然后分別加入空白血漿50μL、內(nèi)標(biāo)工作液150μL及沉淀劑乙腈溶液750μL,渦旋30s混勻,配制成濃度分別為5,10,30,100,300和1000ng·mL按上述方法配制濃度為10,100和800ng·mL6含藥血漿樣品采用蛋白沉淀法對血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理。離心管中分別加入含藥血漿樣品50μL、內(nèi)標(biāo)工作液的150μL和乙腈750μL,渦旋振蕩3min,立即在13000r·min7峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比對樣品濃度的影響按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作,采用LC-MS/MS法進(jìn)行血漿樣品的分析測定,以色瑞替尼的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比對樣品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品采用相同的計(jì)算方法分析,將樣品信號的峰面積與內(nèi)標(biāo)信號的峰面積之比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到待測樣品的濃度,即x=(y-b)/a,其中y為色瑞替尼信號峰面積與內(nèi)標(biāo)信號峰面積之比,a為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率,b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距。結(jié)果1回收率及樣品預(yù)處理生物樣本測定步驟包括:(1)標(biāo)準(zhǔn)血漿的制備(包括對照品純度、稱量、容量瓶和移液器允差、加入空白血漿和內(nèi)標(biāo)等)。(2)生物樣本預(yù)處理(包括提取回收率)。(3)儀器允差。(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。(5)溫度等。2標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定不確定度的評定方法主要可分為不確定度A類評定和不確定度B類評定。不確定度的A類評定指用對觀測列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的方法來評定標(biāo)準(zhǔn)不確定度(以標(biāo)準(zhǔn)差表示的測量不確定度),是由一系列重復(fù)觀測值計(jì)算得到。不確定度的B類評定指用不同于對觀測列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的方法來評定標(biāo)準(zhǔn)不確定度,是根據(jù)有關(guān)信息來評定即通過一個(gè)假定的概率密度函數(shù)得到。2.1溫度對測量的影響實(shí)驗(yàn)室溫度控制在(25±2)℃,標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品均在相同溫度下制備和測定,因此溫度引入的不確定度可忽略。2.2合并樣本偏差計(jì)算由重復(fù)觀測(精密度)引入的不確定度屬于A類不確定度。分別配制濃度為5,10,20,100,200和1000ng·mL依據(jù)貝塞爾公式計(jì)算合并樣本偏差:式中,m為測量組數(shù),n為每組的測量次數(shù)(本實(shí)驗(yàn)中,m=3,n=6);k為每組平行測定份數(shù)(1,2,…,n),j為組數(shù)(1,2,…,m)。以每組6個(gè)值的平均值表示測量結(jié)果,低濃度和高濃度質(zhì)控平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為:則測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:2.3回收率及血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立采用減重法稱量,天平靈敏度帶來的不確定度可以忽略不計(jì)。依據(jù)計(jì)量檢定證書,所用天平為十萬分之一電子天平e=0.03mg,按照均勻考慮,天平的非線性誤差分別為u(Δ,Nonlinear),天平自動調(diào)零作為1次扣皮,其a稱量色瑞替尼和內(nèi)標(biāo)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:稱量引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:實(shí)驗(yàn)中所用儀器型號為QTRAP5500三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀,LC-20ADXR液相色譜儀,質(zhì)譜儀定量的最大允差為0.8%,液相色譜儀吸樣的最大允差為0.5%,按照均勻分布,則儀器量化的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:生物樣品中藥物濃度測定時(shí),首先需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到未知樣品的濃度。直線回歸是最常用且最簡單的一種,回歸方程的建立對計(jì)算未知樣品的濃度至關(guān)重要。配制濃度為5,10,20,100,200和1000ng·mL將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血漿R的平均值對濃度進(jìn)行線性回歸得回歸方程,其斜率a=0.00245,截距b=0.0127。式中,P為測定x的總次數(shù)(P=18);N為測定標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的總次數(shù)(N=m×n=18);J為測定標(biāo)準(zhǔn)血漿的序數(shù)(J=1,2,3,…N),J與j不同;i為標(biāo)準(zhǔn)血漿的序數(shù)(i=1,2,3,4,5,6);為m=6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血漿濃度的平均值;為第i個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血漿的濃度。則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:2.4合成不確定度的評估低、中和高濃度的色瑞替尼測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:2.5擴(kuò)展不確定度的評估取k=2,此時(shí)對應(yīng)的置信概率為95%,色瑞替尼低、中和高濃度的擴(kuò)展不確定度分別為:2.6低、中和濃度采用LC-MS/MS方法測定血漿中色瑞替尼時(shí),低、中和高濃度分別表示為(10.245±13.122),(105.962±13.397)和(740.688±125.654)ng·mL標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的影響色瑞替尼是一種口服選擇性酪氨酸激酶抑制劑,可劑量依賴性的抑制ALK和下游信號通路,阻斷ALK依賴的細(xì)胞增殖,于2014年4月29日經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市,主要用于克唑替尼治療后進(jìn)展或不能耐受的晚期ALK陽性轉(zhuǎn)型性非小細(xì)胞肺癌不確定度分量的結(jié)果顯示了影響藥物濃度測定的各個(gè)因素所占的貢獻(xiàn)率(見圖1)。其中,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸對不確定度的貢獻(xiàn)最大。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合對色瑞替尼濃度測定的影響可能與標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、測定點(diǎn)的個(gè)數(shù)和重復(fù)測定次數(shù)密切相關(guān),不同權(quán)重的回歸也會對結(jié)果造成影響。提示在進(jìn)行血漿樣品濃度測定時(shí),為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性,在遵守國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)頒發(fā)的相關(guān)法規(guī)或指導(dǎo)原則的基礎(chǔ)上應(yīng)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳范圍、選擇最佳標(biāo)準(zhǔn)曲線的個(gè)數(shù)(如至少6個(gè)濃度水平)和權(quán)重回歸方法(如加權(quán)最小二乘法),從而將不確定度降至最小,使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠,為建立檢測方法提供科學(xué)指導(dǎo),助力臨床通過準(zhǔn)確的藥物濃度個(gè)體化精準(zhǔn)治療。綜上所述,本研究評定了LC-MS/MS法測定血漿中色瑞替尼濃度的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入。隨著對不確定度概念和應(yīng)用的不斷認(rèn)識,相信不確定度評價(jià)將會在生物分析和藥動學(xué)領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用,從而保證檢測結(jié)果的可靠性和溯源性。2.3.1引入的參照物常數(shù)的不確定度，u2.3.2最大允差規(guī)格(1)量瓶引入的測量不確定的:實(shí)驗(yàn)所用A級量瓶(volumetricflask,VF)規(guī)格為10和50mL,其最大允差為±0.020mL和±0.050mL。按照三角分布,包含因子為2.3.3移液器引起的不確定度在離心管中加入50μL空白血漿、150μL內(nèi)標(biāo)工作液、50μL標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液、750μL乙腈沉淀劑,混勻30s。不確定度主要由移液器引起,所用的移液器為20~200μL,最大允許誤差為±1.2μL,100~1000μL,最大允許誤差為±10μL。由于溫度對移液器的影響較小,忽略不計(jì)。按三角分布,移液器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:配制血漿溶液時(shí)的相對不確定度為:2.3.4提取回收率的計(jì)算配制低(L)、中(M)和高(H)濃度質(zhì)控樣品6份,按“血漿樣品預(yù)處理”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣,LC-MS/MS分析得到的峰面積設(shè)為B;按照相同方法采用沉淀后基質(zhì)配制相同濃度的樣品6份,直接進(jìn)行LC-MS/MS分析,得到峰面積設(shè)為A,則色瑞