分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座

分解纖維素微生物分離JLSSYBYH分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第1頁㈠纖維素與纖維素酶1.纖維素

纖維素是一個(gè)由葡萄糖首尾相連而成高分子化合物，是含量最豐富多糖類物質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識

植物根、莖、葉等器官都含有大量纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高天然產(chǎn)物。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第2頁土壤中一些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第3頁纖維素是地球上含量最豐富多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生纖維素超出70億噸，其中40%-60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶微生物所利用，不會大量積累。在草食性動物等消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素能力。人類可應(yīng)用分解纖維素微生物將秸稈等廢棄物轉(zhuǎn)變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第4頁2.纖維素酶

纖維素酶是一個(gè)復(fù)合酶，普通認(rèn)為它最少包含三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第5頁CX酶：內(nèi)切酶，使纖維素?cái)嗔殉善瑪唷1酶：外切酶，從糖鏈末端開始切掉兩個(gè)葡萄糖分子，產(chǎn)生纖維二糖葡萄糖苷酶：將纖維二糖分解成葡萄糖。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第6頁①取二支20mL試管試驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素試驗(yàn)

濾紙瓦解法②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲乙④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管濾紙條消失

討論：乙試管濾紙條為何會消失？甲試管作用是什么？分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第7頁提醒：本試驗(yàn)自變量是纖維素酶有沒有，自變量操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL）纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量緩沖液，不能加入蒸餾水，不然會影響溶液pH。試驗(yàn)分析：P27小試驗(yàn)是怎樣組成對照？分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第8頁——剛果紅染色法

剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。

（二）纖維素分解菌篩選

當(dāng)我們在含有纖維素培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心透明圈，這么我們就能夠經(jīng)過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第9頁分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第10頁二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

請你依據(jù)試驗(yàn)流程圖和提供三個(gè)資料以及“操作提醒”，在思索相關(guān)問題基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)試驗(yàn)方案。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布在判別纖維素分解菌培養(yǎng)基上篩選產(chǎn)生透明圈菌落分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第11頁①分布環(huán)境1、土壤取樣：富含纖維素環(huán)境中操作步驟生物與環(huán)境相互依存關(guān)系，在富含纖維素環(huán)境中纖維素分解菌含量相對提升，所以從這種土壤中取得目標(biāo)微生物幾率要高于普通環(huán)境。②原因分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第12頁③實(shí)例：樹林中多年落葉形成腐殖土，多年積累枯枝敗葉等。④討論:假如找不到適當(dāng)環(huán)境，能夠?qū)V紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存適宜環(huán)境。普通應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右土壤中。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第13頁2、選擇培養(yǎng)

增加纖維素分解菌濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要微生物。

①目標(biāo)：②制備選擇培養(yǎng)基：③操作：

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第14頁培養(yǎng)基成份分析

培養(yǎng)基組成提供主要營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g

碳源（能源）NaNO31g

氮源、無機(jī)鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g

無機(jī)鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第15頁提醒：自變量為培養(yǎng)基種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖維素改為葡萄糖。A、旁欄中配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為何？是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個(gè)培養(yǎng)基對微生物是否含有選擇作用？假如含有，是怎樣進(jìn)行選擇？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素微生物能夠大量繁殖。C、你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對照試驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基作用分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第16頁說明：分析“纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中酵母膏也能夠提供少許碳源，所以其它微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，因?yàn)榻湍父嗪繕O少，所以，只有以纖維素為碳源微生物才能大量繁殖。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第17頁

在選擇培養(yǎng)條件下，能夠使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件微生物得到快速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件微生物繁殖被抑制，所以能夠起到“濃縮”作用。為何選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需微生物？分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第18頁比較項(xiàng)目分解尿素細(xì)菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基原理培養(yǎng)基類型目標(biāo)鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法將細(xì)菌涂布在只有尿素做氮源選擇培養(yǎng)基上將細(xì)菌涂布在只有纖維素粉做碳源選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株選擇培養(yǎng)分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第19頁思索：本試驗(yàn)流程與課題2中試驗(yàn)流程有哪些異同？

本試驗(yàn)流程與課題2流程區(qū)分以下。課題2是將土樣制成菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題經(jīng)過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其它步驟基本一致。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第20頁按照課題1稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101～107倍。3.梯度稀釋101102103104105106分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第21頁4.將樣品涂布到判別纖維素分解菌培養(yǎng)基上（1）制備判別培養(yǎng)基:（2）涂布平板：將稀釋度為104～106菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第22頁培養(yǎng)基組成提供主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長因子KH2PO40.25g無機(jī)鹽土豆汁100mL碳源、生長因子瓊脂15g凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素判別纖維素分解菌培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉)分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第23頁方法一：先

，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。（后置染色法）方法二：在

時(shí)就加入剛果紅。

（前置染色法）培養(yǎng)微生物倒平板5.剛果紅染色法

挑選產(chǎn)生透明圈菌落，普通即為分解纖維素菌落。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第24頁這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？染色法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法一方法二顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌作用操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便，不存在菌落混雜問題1.產(chǎn)生淀粉酶微生物也產(chǎn)生含糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成顯著透明圈。分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第25頁比較項(xiàng)目分解尿素細(xì)菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)原理培養(yǎng)基類型目標(biāo)鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法在細(xì)菌分解尿素化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)，pH升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會變紅剛果紅能夠與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心透明圈觀察菌落周圍是否有著色環(huán)帶出現(xiàn)來判定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法剛果紅染色法分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第26頁方法一中NaCl溶液作用？思索：

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢剛果紅，以免出現(xiàn)透明圈不夠清楚。用這方法能夠判斷酶活力大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基多糖底物，但分解纖維素細(xì)菌能夠產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這么剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就能夠使結(jié)合不牢剛果紅洗去，這么就留下大大小小透明圈，大透明圈當(dāng)然分解纖維素能就強(qiáng)！分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第27頁

在產(chǎn)生顯著透明圈菌落，挑取并接種到纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可取得純化培養(yǎng)。6、純化培養(yǎng)分解纖維素的微生物的分離公開課專家講座第28頁四、結(jié)果分析與評價(jià)

1.培養(yǎng)基制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。假如觀察到產(chǎn)生透明圈菌落，則說明可能取得了分解纖維素微生物。

2.分離結(jié)果是否一致

因?yàn)樵谕寥乐屑?xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌數(shù)量，所以最輕易分離得到是細(xì)菌。但因?yàn)樗⊥?/p>