經(jīng)典藥用植物丁香假單胞菌dc2000甘油激酶基因克隆及功能研究

經(jīng)典藥用植物丁香假單胞菌dc2000甘油激酶基因克隆及功能研究

譚氏反真菌番茄致病性變異（pseudyer亞甲基鹵單胞菌（pst）d3000是番茄、青椒和其他茄子植物的病原體。這是屬于丁香假單胞菌的。革命蘭的陰性短桿菌，有鞭毛，無瘤膜，無芽。最佳ph值為7.0，最佳生長溫度為2430，黃綠色熒光在kbm培養(yǎng)基中產(chǎn)生。甘油是一種代謝中間產(chǎn)物,廣泛存在于微生物、動(dòng)物和植物中,參與生物的多種脅迫反應(yīng),包括非生物脅迫和生物脅迫甘油在甘油激酶(Glycerolkinase,GK)的催化下,分解形成3-磷酸-甘油(G3P)。G3P在輔酶NAD鑒于GK是甘油代謝中的關(guān)鍵酶,結(jié)構(gòu)相對保守,本研究根據(jù)GenBank中PstDC3000GK氨基酸序列(PSPTO_4168)設(shè)計(jì)引物,通過PCR技術(shù)克隆了PstDC3000GK基因,并對其生物信息學(xué)特征進(jìn)行了分析。然后,利用插入突變的方法,敲除PstDC3000GK基因,探討GK基因缺失對PstDC3000的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1質(zhì)粒及試劑野生型PstDC3000、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒(pK18mob、pLAFR、pRK2073)均由貴州理工學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pMD-18-T購自TAKARA公司。1.1.2化學(xué)試劑的制備蛋白胨、甘油、瓊脂、常用抗生素購自上海生工生物有限公司;磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鎂、無水乙醇、冰醋酸等均為分析純,購于廣州化學(xué)試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;DNA膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒購于上海生工生物有限公司;TaqDNA聚合酶、ExTaqⅡmastermix、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等均為TAKARA公司產(chǎn)品。1.1.3培養(yǎng)基1.2測試方法1.2.1pstdc3000擴(kuò)增gk基因嚴(yán)格參考試劑盒說明書提取PstDC3000基因組DNA,通過核酸紫外分光法分析其質(zhì)量與濃度。以GenBank中所提交的PstDC3000GK氨基酸序列為依據(jù),利用Primer5.0分析軟件,設(shè)計(jì)1對克隆引物(表1)。以PstDC3000基因組DNA為模板,通過PCR的方法擴(kuò)增GK基因,擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,60℃退火60s,72℃延伸90s,35個(gè)循環(huán);最后72℃終末延伸10min。PCR結(jié)束后,凝膠電泳分析,通過DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化,將產(chǎn)物連接至克隆載體(pMD-18-T)上,通過熱激法將重組DNA分子轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,Amp抗性和X-gal/IPTG藍(lán)白斑篩選陽性克隆。挑取白色菌落進(jìn)行PCR檢測,將陽性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng),采用試劑盒方法提取質(zhì)粒后,雙酶切法進(jìn)行檢測,挑選PCR檢測與雙酶切檢測均為陽性的菌落,送上海生工生物公司進(jìn)行測序。1.2.2orf核心序列的發(fā)現(xiàn)與翻譯利用生物軟件(DNAMAN和BioEdit)對PstDC3000GK基因序列進(jìn)行ORF查找與翻譯。通過序列處理在線工具包(SMS)、瑞士生物信息學(xué)研究中心蛋白質(zhì)專業(yè)分析系統(tǒng)以及國際生物測量學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在線系統(tǒng)等分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。1.2.3pstdc3000gk氨基酸序列的分析利用整合突變的方式,借助輔助質(zhì)粒pRK2073,通過三親本結(jié)合實(shí)現(xiàn)對PstDC3000GK基因的敲除。方法如下:根據(jù)PstDC3000GK氨基酸序列設(shè)計(jì)缺失突變引物(表1),利用野生型PstDC3000菌體基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,方法參考1.2.1。分別將受體菌PstDC3000、供體菌(帶有重組質(zhì)粒的DH5α)、輔助菌DH5α/pRK2073接種在含適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD1.2.4pstdc3000檢測根據(jù)PstDC3000GK氨基酸序列設(shè)計(jì)1對GK基因全長回復(fù)突變引物(表1)。以PstDC3000菌體基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,方法參考1.2.1。將構(gòu)建正確的回復(fù)突變質(zhì)粒通過三親本結(jié)合方式轉(zhuǎn)化至GK基因突變體中,實(shí)現(xiàn)GK基因缺失的回復(fù)突變。將構(gòu)建正確的GK基因缺失回復(fù)突變體命名為PstDC3000△GK/pLA。1.2.5gk蛋白表達(dá)量的檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法(羅氏Lightcycler480系統(tǒng))檢測PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA中GK的表達(dá)量。以16SRNA為內(nèi)參,擴(kuò)增體系:10μmol/L引物各0.8μL,2×SYBRGreenMix10μL,基因組DNA2μL,補(bǔ)水至20μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3min;95℃變性10s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40個(gè)循環(huán);最后72℃終末延伸10min。按照21.2.6測定細(xì)菌生長特性將待測菌株P(guān)stDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA過夜培養(yǎng),調(diào)整至OD1.2.7檢測菌株和儀器將待測菌株P(guān)stDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA過夜培養(yǎng),4000r/min離心2min收集菌體,加入TrisHCl重懸,超聲破碎儀破碎菌體細(xì)胞,4000r/min離心2min收集上清液,用于HPLC測定。進(jìn)樣體積為10μL;色譜柱為氨基柱;流動(dòng)相為乙腈∶水(75∶25);流速1.0mL/min;檢測器為RID。按照甘油標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積值大小分析樣品中甘油的含量。1.2.8接種葉片測定將菌株P(guān)stDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA過夜培養(yǎng)至OD選取生長健壯、3周左右的野生型擬南芥(Col-0)葉片,進(jìn)行接種試驗(yàn)。通過注射器將菌體注入葉片內(nèi),擦拭多余菌液,保濕。接種1h(0d)、4d后,打孔器取樣,放進(jìn)已稱質(zhì)量的EP管中。然后再次稱質(zhì)量,計(jì)算出葉片的質(zhì)量。充分磨碎葉片,用MgCl1.3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析,用Excel中t測試分析數(shù)據(jù)差異顯著性。2結(jié)果與分析2.1pstdc3000gk基因的擴(kuò)增、測序采用試劑盒法提取的PstDC3000基因組DNA,經(jīng)紫外核酸蛋白儀檢測顯示,OD以PstDC3000基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增得到1條約1500bp大小的特異性條帶(圖2)。測序結(jié)果表明,PstDC3000GK基因全長1506bp,可編碼一條501個(gè)氨基酸組成的多肽(圖3)。BLAST顯示,克隆的PstDC3000GK氨基酸序列與GenBank中登錄的序列相似性為100%,說明已成功克隆了PstDC3000GK基因。2.2pstcd3000gk序列分析2.2.1gk蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和大小分析瑞士生物信息學(xué)研究中心蛋白質(zhì)專業(yè)分析系統(tǒng)在線結(jié)果顯示,PstDC3000GK蛋白分子質(zhì)量為55.8ku,等電點(diǎn)為5.54。2.2.2氨基酸n,k,r序列處理在線工具包(SMS)分析結(jié)果表明,PstDC3000GK堿性氨基酸(K、R)個(gè)數(shù)為49;酸性氨基酸(D、E)個(gè)數(shù)為42;疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)個(gè)數(shù)為241;極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)個(gè)數(shù)為157;脂肪族氨基酸(I、L、V)有101個(gè);芳香族氨基酸(F、W、Y)有45個(gè)。2.2.3pstdc3000gk蛋白信號肽SignalPV3.0WorldWideWebServer分析顯示,PstDC3000GK蛋白信號肽位于N-端第1位與32位氨基酸殘基之間,成熟蛋白質(zhì)為469個(gè)氨基酸。2.2.4gk蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測國際生物測量學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及蛋白質(zhì)生物學(xué)和化學(xué)研究所的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果表明:PstDC3000GK無規(guī)卷曲為53.29%,α-螺旋為25.95%,β-折疊為20.76%。2.3gk缺乏對pstcd3000的影響2.3.1dc3000gk基因的缺失表達(dá)熒光定量PCR結(jié)果顯示,通過整合突變后,PstDC3000△GK中GK基因已被敲除,沒有表達(dá)?；貜?fù)突變體PstDC3000△GK/pLA中,GK基因已被恢復(fù),表達(dá)量接近野生型水平(圖4)。2.3.2pstdc3000gk/pla生長速率在M9基本培養(yǎng)基中,PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA均生長良好,說明PstDC3000△GK不是營養(yǎng)缺陷型。但突變體PstDC3000△GK生長速率與PstDC3000相比,明顯變慢,回復(fù)菌PstDC3000△GK/pLA的生長基本得到恢復(fù),與PstDC3000相比沒有差異(圖5A)。在TSA(不含甘油)培養(yǎng)基中,PstDC3000、PstDC3000△GK及PstDC3000△GK/pLA的生長速率明顯高于M9培養(yǎng)基中的生長速率。同樣,GK突變體的生長速率明顯降低,而回復(fù)突變體的生長速率基本恢復(fù)正常(圖5B)。在KBM培養(yǎng)基(含甘油)中,PstDC3000△GK的生長速率同樣低于PstDC3000和PstDC3000△GK/pLA,且差異明顯大于TSA培養(yǎng)基(5C)。2.3.3pstdc3000gk/pla細(xì)胞內(nèi)甘油含量的變化測定結(jié)果表明,GK基因缺少導(dǎo)致PstDC3000△GK細(xì)胞內(nèi)積累高濃度的甘油,PstDC3000△GK/pLA細(xì)胞內(nèi)甘油含量基本恢復(fù)至野生型水平(圖6)。2.3.4pstdc3000gk菌體克隆數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明,接種野生型Col-0擬南芥4d后,PstDC3000△GK菌體克隆數(shù)顯著低于PstDC3000,而PstDC3000△GK/pLA菌體數(shù)量接近PstDC3000的水平(圖7)。3pstdc3000gk基因的缺失引起高效水回復(fù)突變體的生長GK催化甘油生成3-磷酸-甘油,是甘油代謝中的關(guān)鍵酶。GK基因先后從大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以及腦膜炎膿毒性黃桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)等多種微生物細(xì)胞中被克隆出來,在大腸桿菌中進(jìn)行了原核表達(dá),同時(shí)酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也得到了分析在本研究中,克隆的PstDC3000GK基因大小1506bp,具有編碼501個(gè)氨基酸的開放閱讀框。PstDC3000GK的分子質(zhì)量為55.8ku,成熟蛋白由469個(gè)氨基酸組成,二級結(jié)構(gòu)中富含無規(guī)卷曲,含量高達(dá)53.29%。通過敲除PstDC3000GK基因后,菌株在基本培養(yǎng)基和豐富培養(yǎng)基中的生長速率均明顯低于野生型,而回復(fù)突變體的生長速率基本恢復(fù)正常。GK基因缺失后,突變體內(nèi)積累高濃度的甘油,而高濃度的甘油對細(xì)胞有一定的毒害作用,這可能是導(dǎo)致菌體生長緩慢的原因。另外,接種野生型Col-0擬南芥4d后,GK基因缺失突變菌