鹽附子遺傳毒性研究

鹽附子遺傳毒性研究

采用治療疾病的方法，具有益氣、降壓、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種藥理活性。本藥具有很強(qiáng)的毒性。常用的生川烏、生草烏和生附子屬于國(guó)家特殊處理的毒性中藥。目前烏頭類中藥在文獻(xiàn)中廣泛報(bào)道的主要有心臟毒性和中樞神經(jīng)毒性附子Aconitumcarmichaeli為毛莨科植物烏頭子根的加工品,因其附生烏頭而得名.附子的毒性成分為烏頭堿,可溶于水與乙醇,毒性極大,人口服0.2mg即可產(chǎn)生中毒癥狀,其結(jié)晶2～4mg即可致死.鹽附子是泥附子經(jīng)丹巴鹽浸、晾曬炮制加工而成,是臨床上常用附子的炮制品本文選用目前新藥遺傳毒性評(píng)價(jià)中推薦使用的3種試驗(yàn)(小鼠骨髓微核試驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、體外CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn))研究鹽附子的遺傳毒性。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗(yàn)藥物1.1.2動(dòng)物合格SPF級(jí)NIH小鼠50只,體重25～30g,雌雄各半。購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2004-0005。小鼠飼養(yǎng)于國(guó)家成都中藥安全性評(píng)價(jià)中心SPF動(dòng)物房,飼養(yǎng)條件符合國(guó)標(biāo)GB14922.2-2001。1.1.3rs國(guó)際及生長(zhǎng)網(wǎng)絡(luò)選用TA97、TA98、TA100、TA1535、TA102菌株進(jìn)行試驗(yàn),菌株購(gòu)自DiscoveryPartnersInternational,IncUSA。按照試驗(yàn)要求,對(duì)試驗(yàn)擬用的鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株進(jìn)行了組氨酸需求試驗(yàn)、結(jié)晶紫敏感試驗(yàn)、抗氨芐青霉素試驗(yàn)、抗四環(huán)素試驗(yàn)、紫外線敏感試驗(yàn)、自發(fā)回變?cè)囼?yàn)、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn),結(jié)果顯示:各菌株的特性正常,自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi),陽(yáng)性對(duì)照的回復(fù)突變菌落數(shù)高于相應(yīng)菌株自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)兩倍以上。1.1.4細(xì)胞生物學(xué)研究中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞(ChineseHamsterLungfibroblast,CHL)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1受試藥物組采用5d灌胃將檢疫合格的SPF級(jí)NIH小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,雌雄各半。包括:鹽附子3個(gè)劑量組(15.45、7.73、3.86g生藥/kg)、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組。受試藥物組小鼠每天給藥1次,連續(xù)4d經(jīng)口灌胃給藥,灌胃體積為0.2ml/10g。陽(yáng)性對(duì)照組于處死前1天腹腔注射環(huán)磷酰胺(40mg/kg)。于末次給藥后24h(陽(yáng)性對(duì)照組于給予環(huán)磷酰胺后24h)頸椎脫臼法處死小鼠,取出胸骨骨髓制片,計(jì)數(shù)1000個(gè)多染紅細(xì)胞,并記錄微核發(fā)生率(‰),同時(shí)計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞,求出多染紅細(xì)胞/正染紅細(xì)胞的比值。1.2.2物劑量組植物基因型根據(jù)預(yù)試結(jié)果,鹽附子的高劑量組設(shè)為5mg生藥/皿,以下依次作2倍稀釋。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)受試物劑量組(5.000、2.500、1.25、0.625、0.313、0.156mg生藥/皿),1個(gè)自發(fā)對(duì)照組,1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組,共8組。每組3個(gè)平行皿,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每皿回變菌落數(shù)表示。平行做加和不加S9的試驗(yàn),試驗(yàn)重復(fù)1次。陽(yáng)性對(duì)照藥物使用情況見(jiàn)表1。1.2.3室外chl細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)依據(jù)鹽附子LD2結(jié)果2.1小鼠骨髓微核試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果顯示:陽(yáng)性對(duì)照組小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率明顯高于陰性對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。鹽附子各劑量組小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率與陰性對(duì)照組比較無(wú)明顯升高,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05);各給藥劑量組多染紅細(xì)胞/正染紅細(xì)胞的比值與陰性對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。表明鹽附子對(duì)骨髓細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。見(jiàn)表2。2.2不同劑量組回變菌落數(shù)的測(cè)定鹽附子Ames試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、4。鹽附子,其制備工藝同藥典,濃度為2.4g生藥/ml。在加與不加S9的條件下,TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102的自發(fā)回變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi),5個(gè)菌株的陽(yáng)性對(duì)照均高于相應(yīng)的自發(fā)回變菌落數(shù)兩倍以上,證明試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。鹽附子各劑量組回變菌落數(shù)均未高于相應(yīng)菌株自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍,且無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系。試驗(yàn)重復(fù)一次,所得結(jié)論相同。2.3表6:表6鹽附子體外CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表5、6。表5、表6鹽附子染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果表明:在加S9和不加S9的情況下各劑量組的細(xì)胞染色體畸變率都低于5%,通過(guò)χ3鹽附子在小鼠急性毒性試驗(yàn)中的作用附子具有強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能的作用,其毒性也較大,主要毒性成分為脂溶性二脂類生物堿,毒性表現(xiàn)為神經(jīng)和心血管系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害。鹽附子、黑順片、白附片是臨床上常用附子的炮制品,其中又以鹽附子最為常用在小鼠急性毒性試驗(yàn)中鹽附子LD綜