crisprcas9介導(dǎo)的原養(yǎng)型谷胱甘肽酵母w303-1bfgp轉(zhuǎn)化菌株的構(gòu)建

crisprcas9介導(dǎo)的原養(yǎng)型谷胱甘肽酵母w303-1bfgp轉(zhuǎn)化菌株的構(gòu)建

谷胱甘醇（gsh）是細(xì)胞中含量最高的非蛋白質(zhì)基化合物，通過酶化反應(yīng)合成谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。目前,GSH生產(chǎn)的主要方法是酵母發(fā)酵法。由于野生型釀酒酵母Saccharomycescerevisiae和產(chǎn)朊假絲酵母Candidautilis細(xì)胞中GSH含量高,因此,它們是GSH發(fā)酵生產(chǎn)的重要菌株。提高GSH產(chǎn)量的方法有提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量、提高細(xì)胞生物量Murata等分別在1981年和1983年克隆并測序了編碼GSH生物合成的兩個酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)和GSH合成酶(GSHⅡ)的基因gshA和gshB近年來,串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)及RNA靶向內(nèi)切酶Cas9(CRISPR-Cas9)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速并得以廣泛應(yīng)用。該技術(shù)通過一段短的引導(dǎo)RNA(GuideRNA,gRNA)識別特定的DNA序列,通過改變gRNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種生物如人、小鼠、斑馬魚等的基因編輯本研究旨在通過在釀酒酵母中建立CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù),回復(fù)突變工程菌株W303-1b/FGP為原養(yǎng)型菌株,使其能夠自主合成生命活動中必需的小分子化合物,能在簡單的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長,方便大規(guī)模培養(yǎng)。1材料和方法1.1dna的pcr擴(kuò)增與構(gòu)建大腸桿菌EscherichiacoliTrans1-T1(TransGen公司)用于重組DNA的擴(kuò)增與構(gòu)建。釀酒酵母工程菌株W303-1b/FGP(MATαade2-1leu2-3,112his3-11,15ura3-1trp1-1)(表1)YPD培養(yǎng)基:酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L。1.2通過建立和轉(zhuǎn)移1.2.1cas9編碼框的構(gòu)建以質(zhì)粒pGADT7(Clontech)為基礎(chǔ)構(gòu)建含有編碼Cas9基因的表達(dá)載體,首先用以酵母基因組DNA為模板和引物PGK1_Sph/PGK1_Nde擴(kuò)增3-磷酸甘油酸激酶基因啟動子(PGK1),此后用限制性內(nèi)切酶位點SphⅠ和NdeⅠ定向亞克隆到質(zhì)粒pGADT7中,即得到pGAD-PGK1。由于編碼Cas9的基因較長,分2步進(jìn)行亞克隆到質(zhì)粒pGAD-PGK1中。先用質(zhì)粒模板pX260(Addgene)和引物X260_1/X260_2擴(kuò)增2.2kb片段,用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ亞克隆到pGAD-PGK1;然后再用X260_2/X260_4擴(kuò)增1.8kb片段,用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XhoⅠ亞克隆,即得到含有Cas9編碼框的質(zhì)粒pGAD-Cas9。為消除質(zhì)粒pGAD-Cas9的篩選標(biāo)記leu2,利用引物GADT7_H3/GADT7_Nhe和質(zhì)粒pGAD-Cas9為模板擴(kuò)增ADH1終止子,再用相同的內(nèi)切酶HindⅢ和NheⅠ置換相應(yīng)的DNA區(qū)段,消除長度為1.9kb的篩選標(biāo)記Leu2基因,并保留原始終止子ADH1序列不變,最后利用引物Bla_Nhe/Bla_Not和pPIC6(Invitrogen公司)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增含有殺稻瘟菌素(Blasticidin)抗性篩選標(biāo)記的基因片段,用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和NotⅠ亞克隆到消除篩選標(biāo)記Leu2的pGAD-Cas9質(zhì)粒中,即獲得含有抗性篩選標(biāo)記(Bla)并組成型表達(dá)Cas9的表達(dá)載體pGAD-Cas9-Bla。1.2.2格倫格爾旋轉(zhuǎn)表達(dá)框架的構(gòu)建以DiCarlo等報道的方法1.2.3pcr擴(kuò)增檢測目的基因片段的擴(kuò)增分別以野生型釀酒酵母S288C基因組DNA或含有目的基因的質(zhì)粒為模板,以Ade1/Ade2、Ura1/Ura2、Leu1/Leu2、Trp1/Trp2、His1/His2為引物對,利用PCR擴(kuò)增分別編碼ade2、ura3、1eu2(pGADT7)、trp1(pGBKT7)和his3的目的基因片段,電泳定量觀察?；貜?fù)突變實驗分為3個階段進(jìn)行:首先利用醋酸鋰法提取原養(yǎng)型工程菌W303-1b/FGP1.3ypd液體培養(yǎng)基挑取回復(fù)突變的工程菌株3個陽性克隆于20mLYPD液體培養(yǎng)基中,30℃、250r/mim培養(yǎng)18–24h作為種子液,轉(zhuǎn)接適當(dāng)體積種子至50mL新鮮的YPD培養(yǎng)基中,使得培養(yǎng)液初始OD1.4分析1.4.1干重測量收集5mL菌液,滅菌雙蒸水漂洗2次,100℃下烘干24h。1.4.2濁度測量將培養(yǎng)一段時間的培養(yǎng)液稀釋至適當(dāng)濃度,利用紫外分光光度計測定600nm下的吸光度值(OD1.4.3gsh在細(xì)胞中的提取利用40%乙醇萃取的方法萃取釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的GSH1.4.4sh鶴在細(xì)胞中的產(chǎn)量利用4-(氨磺酰)-7-氟2,1,3-苯并惡二唑(ABD-F)衍生化法測定萃取液中GSH的濃度1.5原生植物產(chǎn)生的gsh性能穩(wěn)定分析挑取3個原養(yǎng)型單克隆于10mL液體WMVIII培養(yǎng)基2結(jié)果2.1crispr和cas9系統(tǒng)的建設(shè)目前文獻(xiàn)報道用于釀酒酵母的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)都是使用含有營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記如ura3的質(zhì)粒載體2.2原養(yǎng)型回復(fù)突變型的篩選將質(zhì)粒pGAD-Cas9-Bla轉(zhuǎn)化進(jìn)入釀酒酵母工程菌株W303-1b/FGP中,將陽性克隆命名為W303-1b/FGP/Cas9。然后,分3次進(jìn)行原養(yǎng)型回復(fù)突變,依次是ade2和ura3、leu2和trp1、his3基因。其操作過程主要是把野生型的目的基因片段和轉(zhuǎn)錄合成靶向相應(yīng)基因的gRNA結(jié)構(gòu)DNA片段按5∶1的比例共轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌株W303-1b/FGP/Cas9中,其中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)同時進(jìn)行多個基因的編輯操作已得到實驗證實2.3營養(yǎng)缺陷菌株和原始菌株的生長周期為觀察營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母工程菌株W303-1b/FGP與原養(yǎng)型工程菌株W303-1b/FGP2.4原始植物的gsh產(chǎn)量為考察工程菌株回復(fù)為原養(yǎng)型后GSH產(chǎn)量的穩(wěn)定性,將菌株W303-1b/FGP3原養(yǎng)型菌株gsh的生長特性近年來,基因組編輯技術(shù)快速發(fā)展,其中CRISPR/Cas9技術(shù)因設(shè)計操作簡便、編輯高效與通用性廣等優(yōu)點而備受關(guān)注2013年酵母產(chǎn)品的全球市場已達(dá)到58億美元,預(yù)計2019年將達(dá)到92億美元目前生產(chǎn)GSH所用的菌株主要為釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母,其中產(chǎn)朊假絲酵母中GSH最高產(chǎn)量可達(dá)2.45g/L研究組前期獲得了組合表達(dá)3條GSH合成途徑的酵母工程菌W303-1b/FGP與營養(yǎng)缺陷型菌株相比,原養(yǎng)型菌株一個很大的優(yōu)點是可以自身合成Trp等必需小分子,這就使得原養(yǎng)型菌株可以在簡單的、化學(xué)成分確定的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(Chemicaldefinedmedium,CDM)中正常生長,而不需要額外添加昂貴的氨基酸。利用CDM進(jìn)行培養(yǎng)有從實驗室搖瓶培養(yǎng)向規(guī)?；糯笊a(chǎn)轉(zhuǎn)化更快、過程再現(xiàn)強(qiáng)以及下游操作簡單等優(yōu)點原養(yǎng)型菌株在WMVIII培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)100代GSH產(chǎn)量不發(fā)生明顯變化,說明該菌株GSH生產(chǎn)能力穩(wěn)定,上游基因改造不會在長時間培養(yǎng)過程中發(fā)生丟失,有利于菌株更深入的工程改造和放大培養(yǎng)。周文龍,唐亮,成凱,等.CRISPR/Cas9介導(dǎo)的高產(chǎn)谷胱甘肽原養(yǎng)型酵母工程菌的構(gòu)建.生物工程學(xué)報,2017,33(12):1999–20