雙氯芬酸鈉緩釋片相對(duì)生物利用度的研究

雙氯芬酸鈉緩釋片相對(duì)生物利用度的研究

二氯芬酸鈉（二氯芬丙烯酸）的化學(xué)名字叫相鄰-（2,6-二氯丁基）-苯乙酸鈉。這是一種非體抗炎劑。其主要作用機(jī)制是抑制環(huán)氧化酶的活性，防止花四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素。材料、對(duì)象和方法1雙氯芬酸鈉對(duì)照品、地西材料、藥品檢定所受試制劑:雙氯芬酸鈉緩釋片,規(guī)格:每片100mg,批號(hào):061001,山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司研制;參比制劑:雙氯芬酸鈉緩釋片(商品名:奧貝),規(guī)格:每片100mg,批號(hào):GZ8303,進(jìn)口商品注冊(cè)證號(hào):H20020541,加拿大奧貝泰克制藥有限公司生產(chǎn);雙氯芬酸鈉對(duì)照品,含量為99.8%,批號(hào):100334-200302,由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;內(nèi)標(biāo):地西泮對(duì)照品,含量為99.8%,批號(hào):171225-200302,由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。甲醇、乙腈為色譜純,由山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠生產(chǎn);水為Millipore去離子水;所用其他試劑均為優(yōu)級(jí)分析純。高效液相色譜儀,包括:510液相色譜輸液泵、2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司產(chǎn)品;N2000雙通道色譜工作站,浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司產(chǎn)品;AR1140電子分析天平,美國(guó)奧豪斯公司產(chǎn)品;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司產(chǎn)品;MVS-1渦旋混合器,北京金北德工貿(mào)有限公司產(chǎn)品;KQ5200E超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。2知情同意書(shū)試驗(yàn)18名男性健康受試者,年齡:(21.06±1.00)歲,體質(zhì)量:(67.86±3.61)kg,身高:(172.10±7.05)cm。受試者試驗(yàn)前經(jīng)病史詢(xún)問(wèn)無(wú)藥物過(guò)敏史、無(wú)精神病史及其他慢性病史;受試者經(jīng)臨床體檢和實(shí)驗(yàn)室檢查符合試驗(yàn)要求,試驗(yàn)前14天內(nèi)未服用任何藥物。在充分了解本試驗(yàn)的試驗(yàn)?zāi)康呐c方法以及可能出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)后,志愿接受試驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)。本試驗(yàn)方案經(jīng)本校第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。3分組、給藥與吸藥18名健康志愿者隨機(jī)分成2組,每組9人。第1組先服用受試制劑,后服用參比制劑;第2組先服用參比制劑,后服用受試制劑;2次給藥間隔時(shí)間(清洗期)為1周。受試者試驗(yàn)前禁食12h,試驗(yàn)當(dāng)日晨空腹用溫開(kāi)水250mL送服藥物;服藥后4h統(tǒng)一進(jìn)低蛋白、低脂肪標(biāo)準(zhǔn)餐;試驗(yàn)期間,禁止任何劇烈活動(dòng)、吸煙、飲酒等。3.1外周血靜脈血采集2組受試者分別服用受試或參比試劑100mg,每組于給藥前及給藥后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、8.0、12.0和24.0h采集上肢靜脈血5mL,并立即移至經(jīng)肝素處理的離心管中,混勻,3500r·min-1離心10min,分離血漿,于-20℃保存待測(cè)。3.2多次給藥后多次給藥后靜脈血樣的檢測(cè)2組受試者分別服用受試或參比試劑,每次100mg,1次/天,連續(xù)4天,分別在第2、3、4天,晨7:00服藥前采血1次,每次5mL,供測(cè)谷濃度用,以確證是否達(dá)到穩(wěn)態(tài)。在多次給藥達(dá)穩(wěn)態(tài)試驗(yàn)的第4天,晨7:00服藥后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0、8.0、12.0和24.0h采集上肢靜脈血5mL,處理同上。色譜柱:DiamonsilC18(200mm×4.6mm,5μm,迪馬公司產(chǎn)品);流動(dòng)相:甲醇-0.025mol·L-1醋酸鈉緩沖液(70:30,冰醋酸調(diào)節(jié)pH7.0);檢測(cè)波長(zhǎng):276nm;流量:1.2mL·min-1;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:室溫;檢測(cè)靈敏度:5×10-3AUFS。4.2乙腈用量的測(cè)定精密吸取血漿400μL,加入內(nèi)標(biāo)地西泮溶液20μL(20mg·L-1),加入乙腈400μL,渦旋振蕩1min,12000r·min-1離心10min,取上清液20μL進(jìn)樣。4.3樣品測(cè)定結(jié)果在本試驗(yàn)分析方法條件下,測(cè)得空白人血漿、空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品、受試者血漿的色譜圖,見(jiàn)圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明,雙氯芬酸鈉和內(nèi)標(biāo)(地西泮)的保留時(shí)間分別為9.50、7.00min。雙氯芬酸鈉分離基線良好,血漿中內(nèi)源性組分對(duì)藥物測(cè)定無(wú)干擾,可確保分析方法的專(zhuān)一性。4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限精密吸取空白血漿200μL,加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL,分別加入一系列不同濃度的雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL,制成相當(dāng)于雙氯芬酸鈉濃度分別為15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1000.00、2000.00μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列血漿樣品,按血漿樣品處理項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣,記錄峰面積,以雙氯芬酸鈉濃度為橫坐標(biāo),雙氯芬酸鈉與內(nèi)標(biāo)物地西泮的峰面積比值為縱坐標(biāo),用最小二乘法進(jìn)行線性回歸,所得的直線回歸方程為y=1.7×10-3x+1.45×10-2,γ=0.9997,雙氯芬酸鈉的線性范圍為15.63～2000.00μg·L-1,定量下限(lowerlimitofquantitation,LLOQ)為15.63μg·L-1。4.5精密度和回收率按標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢測(cè)限項(xiàng)下的方法,配制低、中、高3個(gè)濃度(雙氯芬酸鈉濃度分別為31.25、250.00和1000.00μg·L-1)的質(zhì)量控制(qualitycontrol,QC)樣品,每一濃度日內(nèi)平行測(cè)定5次,連續(xù)測(cè)定3天,根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算QC樣品中雙氯芬酸鈉的實(shí)測(cè)濃度,計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和相對(duì)回收率。低、中、高3個(gè)濃度的雙氯芬酸鈉血漿樣品的日內(nèi)、日間精密度均<15%,相對(duì)回收率為101.59%～110.03%。另用流動(dòng)相配制相應(yīng)濃度的雙氯芬酸鈉溶液,不經(jīng)處理直接進(jìn)樣,記錄雙氯芬酸鈉的峰面積,比較血漿樣品和流動(dòng)相樣品的峰面積,計(jì)算雙氯芬酸鈉在血漿中的絕對(duì)回收率。低、中、高3個(gè)濃度的雙氯芬酸鈉血漿樣品絕對(duì)回收率為73.70%～90.40%,結(jié)果見(jiàn)表1。按上述方法配制低、中、高3個(gè)濃度(雙氯芬酸鈉濃度分別為31.25、250.00和1000.00μg·L-1)的QC樣品,分別對(duì)室溫放置穩(wěn)定性(室溫放置8、16、24h)、長(zhǎng)期冷凍穩(wěn)定性(-20℃條件下7、14、45d)、凍融穩(wěn)定性(反復(fù)凍融3次)進(jìn)行考察。結(jié)果表明,雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,在室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定;在-20℃放置45天內(nèi)穩(wěn)定;經(jīng)過(guò)3次凍融循環(huán)后穩(wěn)定。5統(tǒng)計(jì)處理將血藥濃度數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī),用3P97程序分別進(jìn)行各項(xiàng)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算,并對(duì)生物等效性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果1平均血藥濃度曲線18名健康受試者單次、多次口服雙氯芬酸鈉緩釋片受試制劑與參比制劑后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線,見(jiàn)圖2。2藥房動(dòng)態(tài)參數(shù)18名健康受試者單次、多次口服雙氯芬酸鈉緩釋片受試制劑與參比制劑后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),見(jiàn)表2。3auc0-t、auc0-和cmx的置信區(qū)差異AUC0＿t、AUC0-∞和Cmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后,進(jìn)行方差分析和雙單側(cè)t檢驗(yàn),tmax經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn),結(jié)果表明均無(wú)顯著性差異。AUC0-t、AUC0-∞和Cmax的90%置信區(qū)間分別為(93.2～101.8)%,(91.9～99.5)%,(93.3～103.5)%。根據(jù)AUC0-t計(jì)算相對(duì)生物利用度為(98.0±11.2)%,該結(jié)果表明,單次給藥時(shí),受試制劑與參比制劑具有生物等效性。3.2aucss,三/三因素型AUCss、Cssmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后,進(jìn)行方差分析和雙單側(cè)t檢驗(yàn),tmax經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn),結(jié)果表明均無(wú)顯著性差異。AUCss、Cssmax的90%置信區(qū)間分別為95.70%～100.50%,98.50%～107.60%。Cssmin采用實(shí)測(cè)值,Cssav=AUCss/τ,DF=(Cssmax-Cssmin)/Cssav×100%,根據(jù)AUCss計(jì)算F為(98.25±5.82)%,該結(jié)果表明,多次給藥時(shí),受試制劑與參比制劑具有生物等效性。4安全評(píng)估在試驗(yàn)期間,18名健康受試者均未發(fā)生藥物不良反應(yīng),各項(xiàng)檢查指標(biāo)均正常。流動(dòng)相及制劑的生物等效性研究高效液相色譜法具有靈敏度高、分析速度快、分離效能好、重現(xiàn)性好、應(yīng)用范圍廣等諸多優(yōu)點(diǎn)在方法學(xué)考察過(guò)程中,曾考慮用甲醇-水作為流動(dòng)相;但雙氯芬酸鈉和內(nèi)標(biāo)的分離度差,且2者的保留時(shí)間均較長(zhǎng),改用甲醇-0.025mol·L-1醋酸鈉緩沖液(70:30,冰醋酸調(diào)節(jié)pH7.0)作為流動(dòng)相,獲得了較好的分離度和較短的保留時(shí)間。在血漿樣品處理過(guò)程中,曾采用萃取法,但雜峰較多,干擾待測(cè)物質(zhì)檢測(cè),故改用乙腈蛋白沉淀法處理血漿樣品雙氯芬酸鈉的多種劑型均有研究報(bào)道;但是目前研究的熱點(diǎn)是對(duì)雙氯芬酸鈉緩(控)釋制劑的研究。緩(控)釋制劑由于采用了新技術(shù),改變了其體內(nèi)釋放吸收過(guò)程,因此有必要進(jìn)行體內(nèi)生物利用度比較研究,以證實(shí)其緩(控)釋特征,并證實(shí)其與參比制劑