環(huán)磷酰胺對sd大鼠卵巢功能減退模型的建立

環(huán)磷酰胺對sd大鼠卵巢功能減退模型的建立

卵巢功能低下（dor）是一種臨床表現多樣、病因復雜、進展緩慢的疾病。它指既往正常的卵巢產生卵子的能力減弱,卵泡的質量下降。引起DOR的病因很多,化療是目前已經明確的病因。環(huán)磷酰胺(CTX)是引起卵巢功能損害最大的化療藥物之一。臨床上長期周期性使用CTX,可引起月經不調、閉經、早發(fā)性卵巢功能不全(POI)或卵巢早衰(POF),停藥后一段時間月經可恢復,恢復的時間與用藥劑量和化療的時間有關。本研究采用適當劑量的CTX建立SD雌性大鼠DOR模型,以供實驗研究使用。1材料和方法1.1主要材料1.1.1實驗動物驅動號SPF級Spragne-Dawley(SD)成年大鼠,雌性,鼠齡12周,體質量(230±10)g,由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,實驗設施合格證號和動物合格證號分別為SCXK(粵)2013-0002和NO.44007200002182。本實驗SPF級動物實驗室設施使用許可證號:SYXK(粵)2010-0059。1.1.2病理圖像采集系統(tǒng)JJ2000動物電子秤,BS224S萬分之一電子天平,Bio-RAD680酶標儀,YD62型石蠟包埋機,LeicaRM2235輪式切片機,LeicaTP1020型全自動脫水機,YD-AB型攤烘烤片機,YD-6L型智能冰凍包埋機,ShandonGemini染色機,DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風干燥箱,OlympusDP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng),702超低溫冰箱。1.1.3elisa,elisa,amh試驗注射用CTX(每支0.2g,購自山西普德藥業(yè)有限公司,批號04130301)。0.9%生理鹽水,每支10mL。雌二醇(E2)ELISA試劑盒(批號1306246),促卵泡激素(FSH)ELISA試劑盒(批號1306251),促黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(批號1304252),抗苗勒氏激素(AMH)ELISA試劑盒(批號1304171),抑制素B(INHB)ELISA試劑盒(批號1304261),均購自上海西唐生物科技有限公司。1.2動物的動態(tài)周期給予大鼠標準光照(14h光照,10h黑夜),全價顆粒飼料喂養(yǎng),自由攝食,室溫20～25℃,相對濕度45%～55%。適應性喂養(yǎng)7d,行陰道脫落細胞涂片觀察其性周期變化,選取動情周期為4～5d的大鼠120只開展實驗。將動物分為G1組(生理鹽水組,即空白對照組)和G2組,每組60只。參照劉惠芬等1.3動情周期期一般情況:每周觀察大鼠體質量、精神、飲食、皮毛、排便及活動情況。動情周期:每天08:30取自制細棉簽蘸取0.9%生理鹽水后,輕輕在大鼠陰道內旋轉1周,行陰道涂片,用95%乙醇固定5min,在顯微鏡下觀察細胞的種類和形態(tài)1.4統(tǒng)計處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以2結果2.1正常治療的一般情況兩組大鼠觀察期間全部存活。G1組大鼠外觀體征、行為活動、精神狀態(tài)、攝食、飲水、被毛、呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形狀顏色等均正常。G2組大鼠給藥后出現被毛疏松、活動減少、精神不振、四肢無力等,第6、8周可恢復正常。2.2ctx造模前后大鼠陰道涂片變化G1組大鼠陰道涂片均有規(guī)則的動情周期變化,周期4～5d,中位數4.5d,動情間期1.5～2.5d,中位數2d。G2組大鼠在CTX造模后第1、2、3、4周陰道涂片顯示動情周期發(fā)生改變,規(guī)則的動情周期變化消失,延長7～16d,中位數11d。陰道涂片顯示分泌物少,有較多散在的白細胞,少量上皮細胞,部分有少量的角化細胞和有核細胞,動情間期5～7d,中位數6d。造模后第6周基本恢復正常的動情周期。2.3周降低周、第8周第8周第8周第8周第8周第8周第8周第8周感官評分與G1組比較,G2組大鼠卵巢指數在造模后第1、2、3、4、6周明顯降低(P<0.01),第8周無差異(P>0.05)。G2組造模后第3、4、6周較第1周明顯降低(P<0.05),第8周較第1周無明顯變化(P>0.05),見表1。2.4大鼠造模前后組織結構的變化顯微鏡下G1組大鼠卵巢可清楚地分為皮質和髓質兩部分,皮髓質結構清晰,各級卵泡及黃體的形態(tài)和結構均完整,間質腺少見,血管豐富,未發(fā)現間質炎癥變化及纖維化等病變;髓質充盈,含有豐富的神經、淋巴管和較多的血管,未見充血、變性壞死等異常改變。G2組大鼠造模后從1周開始可見卵巢髓質部分萎縮,皮質明顯增生且纖維化樣變,顆粒細胞層數減少,排列疏松,甚至空泡,原始卵泡、成熟卵泡數減少,初級卵泡、次級卵泡、閉鎖卵泡增加。血管壁增厚,玻璃樣變,內膜纖維化,肌層增厚,部分血管腔狹窄甚至消失。從第4周開始,卵巢形態(tài)開始恢復,第8周卵巢形態(tài)部分恢復,原始卵泡減少,見圖1。2.5血清amh、inhb水平與G1組比較,G2組大鼠FSH在造模后第1、2、3、4、6、8周明顯升高(P<0.01);G2組大鼠造模后第4、6、8周與第1周比較明顯降低(P<0.05),見表2。與G1組比較,G2組大鼠LH在造模后第1、2、3、4、6周明顯升高(P<0.01),第8周無明顯變化(P>0.05),見表3。G2組大鼠E2在造模后第1、2、3、4、6、8周較G1組明顯降低(P<0.01);G2組大鼠造模后第4、6、8周與第1周比較明顯升高(P<0.05),見表4。與G1組比較,G2組大鼠血清AMH在造模后第1、2、3、4、6、8周明顯降低(P<0.01);G2組大鼠造模后第3、4、6、8周與第1周比較明顯升高(P<0.05),見表5。G2組大鼠INHB在造模后第1、2、3、4、6、8周較G1組明顯降低(P<0.01);G2組大鼠造模后第6、8周與第1周比較明顯升高(P<0.05),見表6。3ctx單次注射能制造sd大鼠離體卵巢功能損害POI是女性在40歲之前卵巢衰退的臨床綜合征,以月經紊亂(如停經或稀發(fā)月經)伴有高促性腺激素和低雌激素為特征CTX是影響卵巢功能最大的化療藥物之一。它屬于細胞周期非特異性藥物,作用于細胞DNA而引起DNA單鏈或雙鏈的斷裂,導致DNA、RNA和蛋白質的合成受到抑制而使卵巢功能損傷。長時間使用高劑量CTX,容易引發(fā)永久性卵巢損傷,繼而導致卵巢衰竭DOR屬于POI、POF的前期狀態(tài),病情相對較輕,盡早治療,卵巢功能尚有機會恢復正常。POF屬于卵巢衰竭終末期,卵巢功能基本不能逆轉。因此制造DOR動物模型要求大鼠卵巢功能有一定的損害,但又不能損害太嚴重。有學者本研究發(fā)現:在整個觀察期間,兩組造模大鼠無死亡,說明這種造模方法安全。CTX造模后1、2、3、4周動情周期延長7～16d,動情間期延長5～7d;卵巢組織中原始卵泡、成熟卵泡數減少,初級卵泡、次級卵泡、閉鎖卵泡增加;卵巢指數在造模后第1、2、3、4、6周明顯降低,FSH、LH在造模后第1、2、3、4、6周明顯升高,E2、AMH、INHB在造模后第1、2、3、4、6、8周明顯降低。表明CTX75mg/kg單次腹腔注射用藥建立卵巢功能損害的大鼠模型是成功的,與文獻報道一致。造模后2周AMH較造模后1周稍有升高,造模后3周E2較造模前2周稍有升高,造模后4周INHB較造模前3周稍有升高。造模后6周大鼠恢復規(guī)律的動情周期,卵巢組織形態(tài)恢復,但(下轉第2188頁)原始卵泡數減少。造模后第8周卵巢指數較前6周稍有升高。說明CTX對卵巢儲備功能損傷是肯定的,但模型有一定的自我修復能力,并未形成卵巢衰竭的狀態(tài),符合DOR的疾病發(fā)病特點。眾所周