轉(zhuǎn)錄水平檢測甲胎蛋白

會計學(xué)1甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP)(GenBank登錄號:NM_001134.1)的異常表達與肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤有關(guān)，請根據(jù)基因表達的檢測方法，設(shè)計實驗方案從轉(zhuǎn)錄水平檢測AFP的表達情況。實驗方案包括：實驗?zāi)康?、實驗方法及原理、技術(shù)路線、可能的結(jié)果分析及應(yīng)用等。討論題目第1頁/共13頁甲胎蛋白是人胚胎期血清中的主要蛋白成分。甲胎蛋白是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細(xì)胞，在胎兒13周AFP含量占血漿蛋白總量的1/3，胎兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失。在妊娠30周達最高峰，以后逐漸下降，出生時血漿中濃度為高峰期的1%左右，約40mg/L，在周歲時接近成人水平。正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升，如在成人血清中含量過高，則提示有肝癌的可能。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）第2頁/共13頁1、掌握RT－PCR技術(shù)、northern印記雜交的原理和方法2、了解實驗的操作方法和步驟3、判斷基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況實驗?zāi)康牡?頁/共13頁使用細(xì)胞RNA提取技術(shù)，然后通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，測定AFPmRNA的表達。逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶或隨

機引物的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段檢測基因表達。實驗方法及原理第4頁/共13頁1、提取mRNA2、反轉(zhuǎn)錄ｃDNA鏈4、凝膠電泳3、PCR擴增5、結(jié)果顯示實驗技術(shù)路線第5頁/共13頁1、若有AFP基因表達，則在與其反轉(zhuǎn)

錄cDNA鏈分子量平行處應(yīng)有檢測信號。

2、若AFP基因未表達，則在與其反轉(zhuǎn)

錄cDNA鏈分子量平行處沒有檢測信號。結(jié)果分析第6頁/共13頁Northern印跡雜交是指將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后利用雜交反應(yīng)來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小的過程。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western

blot。Northern印記雜交實驗原理第7頁/共13頁1、若出現(xiàn)明顯雜交帶，則表明細(xì)胞組織內(nèi)有AFP基因的表達，則會有患肝癌的風(fēng)險。2、若沒有出現(xiàn)明顯雜交帶，則表明細(xì)胞組織內(nèi)基因未表達。結(jié)果分析第8頁/共13頁Northern印跡雜交技術(shù)檢測mRNA表達水平的敏感性較PCR技術(shù)低，但其特異性強，假陽性率低，因此被認(rèn)為是最可靠的mRNA和miRNA定量分析方法之一。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。Northern印記雜交與PCR方法的比較第9頁/共13頁診斷原發(fā)性肝癌。檢測AFP的含量是診斷原發(fā)性肝癌的重要手段之一，由于肝癌的癌細(xì)胞能合成或分泌較多的AFP釋放入血的緣故。正因為如此，醫(yī)生們就把檢測人體血液中的AFP作為診斷肝癌的重要依據(jù)，并把AFP稱為“肝癌標(biāo)志物”。檢測AFP是診斷肝癌的一種簡便、靈敏、快捷的方法，現(xiàn)認(rèn)為它在發(fā)現(xiàn)早期肝癌方面有獨一無二的價值，用AFP診斷肝癌的“專一性”僅次于病理學(xué)檢查。血清AFP升高，還可出現(xiàn)于畸胎瘤、睪丸和卵巢腫瘤等。急性肝炎和肝硬化的鑒別診斷肝細(xì)胞再生時期，AFP在血液中呈陽性，急、慢性肝炎、肝硬化時會有肝細(xì)胞再生，因而AFP在血液中的濃度升高。一般急性肝病，可隨病情好轉(zhuǎn)

AFP含量下降或正常，肝硬化可呈下降或持續(xù)低水平，肝癌則逐漸上升。應(yīng)用（臨床意義）第10頁/共13頁先天性疾病的診斷先天性疾病的診斷：檢測羊水中AFP含量的意義已引起注意，Rendle用放射免疫法檢測，發(fā)現(xiàn)無腦兒羊水中含量顯著升高。正常妊娠12～16周羊水AFP含量為21.1±1.2mg/L，以后逐月下降，足月時為0.5±0.2mg/L。無腦兒患者在妊娠26～31周為95.7±19.3mg/L，32-38周為25.7±5.9mg/L。先天性腎病及脊柱裂也有類似報道。因此用放免法檢測羊水中AFP含量，有助于某些先天性疾病的出生前診斷。母體血中A