生物制藥工藝學(xué)課件公開課一等獎(jiǎng)?wù)n件省賽課獲獎(jiǎng)?wù)n件

生

物

制

藥

工

藝

學(xué)

生物制藥工藝學(xué)

主講教師：吳梧桐專家

第1頁(yè)《生物制藥工藝學(xué)》主要參照書

1．吳梧桐主編《生物制藥工藝學(xué)》第二版，北京，中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2023.2．王志軍主編《生物技術(shù)藥品研究開發(fā)和質(zhì)量控制》，北京，科學(xué)出版社，2023.3．吳劍波《微生物制藥》，北京，化學(xué)出版社，2023.

雜志期刊：1.中國(guó)抗生素雜志.2.藥品生物技術(shù).3.中國(guó)生物工程學(xué)報(bào).4.中國(guó)生化藥品雜志.5.中國(guó)天然藥品.6.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè).第2頁(yè)生物制藥工藝學(xué)Biopharmaceuticalprocess

一、學(xué)習(xí)本課程目標(biāo)：1、培養(yǎng)自己掌握扎實(shí)專業(yè)知識(shí)，具有創(chuàng)新、創(chuàng)業(yè)能力高素質(zhì)人才，按聯(lián)合國(guó)科教文組織對(duì)世界大學(xué)生要求：（1）Learntoknow.(2)Learntodo.(3)Learntobe.(4)Learntotogether.2、培養(yǎng)自己成為藥品研究、生產(chǎn)、流通、應(yīng)用與管理專門人才。為人民防病、治病、保健、康復(fù)提供療效好，副作用少，價(jià)格便宜，使用方便生物藥品。第3頁(yè)二、本課程性質(zhì)：是生物技術(shù)、生物工程、海洋藥學(xué)、生化制藥、微生物制藥、、生物技術(shù)制藥專業(yè)必修課，也是藥學(xué)專業(yè)主要選修課。三、本課程研究?jī)?nèi)容是從事各類生物藥品研究，生產(chǎn)和制劑工藝過(guò)程一門綜合性應(yīng)用技術(shù)科學(xué)。（1）生化與微生物藥品制造工藝。（2）生物技術(shù)藥品與生物制品制造工藝。（3）其他生物醫(yī)藥產(chǎn)品（康復(fù)保健品）制造工藝。四、學(xué)習(xí)任務(wù)與要求：（1）掌握制造工藝基本原理及有關(guān)基礎(chǔ)理論。（2）純熟制造技術(shù)過(guò)程及制劑技術(shù)。（3）熟悉生物藥品起源、構(gòu)造、性質(zhì)及臨床用途。第4頁(yè)第一章生物藥品概述

IntroductionofBiopharmaceutics

1．藥品

Medicine(remedy)藥品是用于預(yù)防、治療或診斷疾病與調(diào)整機(jī)體生理功能、促進(jìn)康復(fù)促健物質(zhì)，有4大類：（1）預(yù)防藥品：如疫苗、卡介苗、艾滋病疫苗、SARS疫苗、腫瘤疫苗。（2）治療藥品：如抗生素、INS、尿激酶。（3）診斷藥品：如肝腎功能檢查試劑盒、免疫診斷試劑盒。（4）康復(fù)保健藥品：如維生素、氨基酸、葉酸。第5頁(yè)2．藥品Drug直接用于臨床藥品制劑產(chǎn)品，是特殊商品。藥品特點(diǎn)：有固定組成，明確要求有適應(yīng)癥、使用方法與用量，療程，并說(shuō)明也許存在毒副反應(yīng)。還要求使用有效期。藥品有3大類：（1）化學(xué)藥品，（2）生物藥品，（3）中藥（藥材，飲片，中成藥）。

第6頁(yè)

生物藥品Biopharmaceutics

是以生物材料（生物體、生物組織或其成份：組織、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞成份、代謝物、排泄物）為原料，綜合應(yīng)用生物學(xué)、物理化學(xué)與當(dāng)代藥學(xué)原理與辦法加工制成藥品。一般有5類：（1）生化藥品Biochemicalmedicine（2）微生物藥品Microbialmedicine（3）海洋藥品Marinemedicine（4）生物制品Biologics(biologicals)（5）生物醫(yī)藥產(chǎn)品Biologicalmedicinalproducts第7頁(yè)伴隨生物技術(shù)藥品迅速發(fā)展，當(dāng)代生物藥品已形成4大類：（1）重組DNA藥品（包括基因工程和蛋白質(zhì)工程藥品）（2）基因藥品geneticmedicine（核實(shí)類藥品，以遺傳物質(zhì)DNA、RNA為治療物質(zhì)基礎(chǔ)藥品），如核實(shí)疫苗、反義藥品。（3）天然生物藥品（4）合成或半合成藥品。第8頁(yè)第一節(jié)生物藥品研究與發(fā)展前景一、生物藥品研究發(fā)展現(xiàn)狀生物藥品發(fā)展已走過(guò)傳統(tǒng)生物制藥技術(shù)和工業(yè)化生物制藥時(shí)代，從1982年10月rhIns上市，正式步入當(dāng)代生物制藥階段。1、世界現(xiàn)狀：已上市200多種生物技術(shù)藥品，已進(jìn)入Ⅲ其臨床400種；其中200種進(jìn)入FDA審批，尚有700多種進(jìn)入Ⅰ-Ⅱ期臨床，在各個(gè)不一樣臨床前研究有2600多種。第9頁(yè)二、生物藥品發(fā)展與展望1．生物技術(shù)藥品研究已進(jìn)入蛋白質(zhì)工程藥品時(shí)代第一代重組藥品時(shí)代：一級(jí)構(gòu)造與功能和天然活性蛋白質(zhì)完全同樣；第二代重組藥品時(shí)代：對(duì)天然產(chǎn)物體現(xiàn)物進(jìn)行簡(jiǎn)單修飾，如PEG化或糖基化；第三代重組藥品時(shí)代：蛋白質(zhì)工程藥品，在DNA水平上，合理設(shè)計(jì)、改造、創(chuàng)制新型治療蛋白。目標(biāo)：（1）提升活性；（2）減少或消除毒副作用；（3）提升體內(nèi)外穩(wěn)定性；（4）產(chǎn)生新功能特性。如：迅速Ins，B9-Ser→B9-Asp,B27-Thr→B27-Glu長(zhǎng)期有效Ins,B21-Asn→B21-Gly,B-C末端加入2個(gè)ArgPI由pH5.4→pH6.8第10頁(yè)2.中國(guó)現(xiàn)狀：（1）生產(chǎn)生化藥品100多種，抗生素近100種；（2）已同意生物技術(shù)藥品30多種：如INF-α1b,INF-α2a,INFα2b,INF-γ,IL-2,IL2-ser125,IL-11,G25F,GM-CSF,γ-SK，γGH，EPO，TPO，EGF，EGF衍生物，bFGF，Ins，TNF衍生物，腦鈉素，心鈉素，抗IL-8單抗乳膏劑，胸苷激酶基因工程細(xì)胞制劑，CHO乙肝疫苗，痢疾疫苗，WuT3單抗（抗CD3CMAb，抗腎移植排斥），131I-chTNT人鼠嵌合型單抗（治肺癌），P53腺病毒抗癌注射劑，葡激酶等，已進(jìn)入臨床有SARS疫苗，禽流感疫苗，艾滋病疫苗。中國(guó)生物制藥公司近代生物制藥公司通過(guò)GMP廠家已近200家，年產(chǎn)值400多億元，僅占全國(guó)醫(yī)藥產(chǎn)值7.5%發(fā)展空間可觀（美國(guó)400多億美元/年），已開始進(jìn)入自主創(chuàng)新階段。如：（1）γ-bFGF(全球首家上市)；（2）思凱通（注射SK，1997年上市）；（3）注射用重組葡激酶（2023年上市）；（4）今又生Gendicine（P53腺病毒注射劑）；（5）TNF衍生物第11頁(yè)2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞體現(xiàn)產(chǎn)物所占比重迅速增加2023年已同意創(chuàng)新生物技術(shù)藥品：酵母體現(xiàn)產(chǎn)品2種，E.coli體現(xiàn)產(chǎn)品4種，分子量均在3.5KDa~6KDa,表達(dá)它體現(xiàn)多肽有優(yōu)勢(shì)，而通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞體現(xiàn)系統(tǒng)22種（包括抗體、酶、凝血因子）如：TNKase(t-pA突變體)；（58KDa）；AlsuraZyme（laromidase）(58KDa治療粘多糖病)Fabrazyme（Algasidasebeta,100KDa,治療Fabry’s?。?.治療性抗體發(fā)展迅猛FDA已同意17種治療性抗體，在抗腫瘤、治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，避免感染、抗血小板凝集等方面療效突出。在369種進(jìn)入臨床試驗(yàn)生物技術(shù)藥品中有75種是抗體類產(chǎn)品，估計(jì)2023年會(huì)有17種上市。如抗TNFα嵌合抗體，TNFα-R-Fc融合蛋白?？贵w人源化分為（1）嵌合抗體：用人源抗體恒定區(qū)替代鼠源抗體恒定區(qū)，保存抗體可變區(qū)。(2)人源化抗體:可變區(qū)中僅CDR（輕鏈可變區(qū)）為鼠源，其FR及恒定區(qū)均來(lái)自人源。第12頁(yè)4、干涉RNA（RNAi）RNAinterference，是細(xì)胞內(nèi)外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA，可引發(fā)與其同源mRNA特異性減少，抑制基因體現(xiàn)，是抗病毒、抗腫瘤治療劑主要設(shè)計(jì)方向。5、基因治療劑：DNA疫苗與基因藥品發(fā)展迅速，將功能基因與體現(xiàn)載體重組，導(dǎo)入人體細(xì)胞，使其在體內(nèi)體現(xiàn)活性蛋白，產(chǎn)生免疫或治療作用。已研究成功乳腺癌DNA疫苗（也許對(duì)病毒性腫瘤均可取得成功），尚有黑色瘤基因治療也取得突破（使病人晚期腫瘤消失），將病人T-cell分離出來(lái)，用腫瘤抗原受體基因改造T-cell，再注入人體，能夠?qū)谏亓霎a(chǎn)生有效清除作用。第13頁(yè)

第二節(jié)

生物藥品性質(zhì)與類別一、生物藥品特性（CharacterizationofBiopharmaceutics）（一）生物學(xué)特性：1、組成、構(gòu)造與天然活性物質(zhì)一致，是生物進(jìn)化與自然選擇成果。2、具有調(diào)整、控制生物功能，戰(zhàn)勝疾病物質(zhì)基礎(chǔ)。3、對(duì)人體進(jìn)行補(bǔ)充、調(diào)整、增強(qiáng)、抑制，替代或糾正代謝失調(diào)更為合理和有效。4、活性強(qiáng)，毒副作用一般較少，針對(duì)性強(qiáng)，療效確切，尚有營(yíng)養(yǎng)作用。5、是創(chuàng)新藥品優(yōu)良先導(dǎo)物，通過(guò)度子設(shè)計(jì)能夠研制新型有效藥品，如從抑長(zhǎng)素研制環(huán)己肽（環(huán)6肽）。28肽———環(huán)6肽

Pro-Phe-D-TrpPe-Thr-Lys第14頁(yè)(二)、化學(xué)特性：（1）含量低、雜質(zhì)多、工藝復(fù)雜、收率低、技術(shù)要求高；（2）組成構(gòu)造復(fù)雜，具嚴(yán)格空間構(gòu)造，才有生物活性。對(duì)多種物理、化學(xué)、生物學(xué)原因不穩(wěn)定，故研究時(shí)要執(zhí)行GLP規(guī)范，生產(chǎn)時(shí)要求GMP管理。（3）活性高，有效劑量小，對(duì)制品有效性，安全性要嚴(yán)格要求（包括標(biāo)準(zhǔn)品制定）。第15頁(yè)二、生物藥品類別：共分4大類（一）天然生物藥品1．微生物藥品microbilmedicine由微生物產(chǎn)生生理活性物質(zhì)：包括初級(jí)及次級(jí)代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。（1）抗生素：抗菌、抗腫瘤抗生素，如青霉素，鏈霉素，紅霉素，四環(huán)素，多粘菌素，兩性霉素B，氯霉素，利福霉素，磷霉素等。（2）酶抑制劑：如克拉維酸，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(青霉素增效劑)（3）免疫抑制劑:如環(huán)孢霉素A第16頁(yè)2．生化藥品（含海洋藥品）：Biochemicalmedicine用生物化學(xué)原理與技術(shù)從動(dòng)植物、海洋生物和微生物制取生化活性物質(zhì)。（1）氨基酸類藥品aminoAcid如胱AA、色氨酸、精氨酸等。（2）多肽類藥品Polypeptide如縮宮素、加壓素等。（3）蛋白質(zhì)類藥品如人血白蛋白，r-球蛋白（4）酶類藥品如胃蛋白酶，尿激酶（5）輔酶類藥品如CoQ10,CoASH（6）核苷酸與核酸類藥品如RNA注射液：PolyI:C（7）多糖類藥品（polysaccharide）:如肝素、玻璃酸。（8）脂類藥品：如去氫膽酸，膽紅素、PGE1、PGE2。第17頁(yè)

（二）生物技術(shù)藥品（新生物制品）Biotech-drugs1.DNA重組藥品（DNArecombinantmedicine）－基因工程與蛋白質(zhì)工程藥品（1）細(xì)胞因子干擾素類藥品:IFNα,IFN-β,IFNγ（2）細(xì)胞因子白介素類和腫瘤壞死因子:IL-2,IL-6,IL-11;TNF-,TNF-R（3）造血系統(tǒng)生長(zhǎng)因子類：G-CSF,GM-CSF,EPO,TPO,SCF（4）重組蛋白和多肽類激素藥品：Ins，rHGH,FSH,LH,HCG（5）生長(zhǎng)因子類藥品:EGF，PDGE，TGFα，NGF（6）心血管病治療劑與酶制劑:水蛭素，t-PA，尿激酶，門冬酰胺酶（7）重組蛋白疫苗與基因工程治療性抗體：乙肝疫苗、丙肝疫苗、對(duì)淋巴瘤CD3單抗（OKT3）抗排斥。HER-2（表皮生長(zhǎng)因子受體抗體），抗乳腺癌轉(zhuǎn)移（人源化抗體）第18頁(yè)2.基因藥物（核酸類藥物）(1)核酸疫苗：將目基因與表達(dá)載體構(gòu)建成重組體導(dǎo)入人體，使其表達(dá)免疫蛋白，呈遞免疫應(yīng)答，如乳腺癌疫苗。(2)反義藥物ISIS2900，用于治療巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎。（三）合成或半合成生物藥物：如催產(chǎn)素，降鈣素，PEG-腺苷脫氨酶，PEG-門冬酰胺酶第19頁(yè)第二章生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

第一節(jié)微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

一、菌種選育與保芷1．自然選育是一種純種選育辦法，根據(jù)自發(fā)突變?cè)?，通過(guò)不停分離篩選，除去衰變型菌落，選擇高產(chǎn)菌，達(dá)成強(qiáng)化、復(fù)壯、穩(wěn)定生產(chǎn)目標(biāo)。操作：?jiǎn)捂咦討腋∫骸蛛x及單菌落培養(yǎng)→篩選純培養(yǎng)：從一種單細(xì)胞微生物取得后裔培養(yǎng)稱純培養(yǎng)辦法：（1）平板劃線法（2）稀釋平板法第20頁(yè)2．誘變育種

（1）誘變處理：①化學(xué)誘變；②物理誘變

（2）代謝調(diào)整選育

（3）基因重組技術(shù)變化代謝途徑

（4）原生質(zhì)體融合

突變株篩選一般進(jìn)程如圖所示

第三第四輪同第二輪第21頁(yè)3．菌種保存

（1）保存目：防止退化（2）菌種退化檢查方法（3）菌種退化防止方法（4）菌種保芷方法：①斜面低溫保存4℃，濕度<70%，細(xì)菌可保存1月，放線菌2月，酵母4～6月；②液體石蠟封芷法121℃×30mm滅菌，干燥，封管；③甘油冷凍法；④冷凍干燥法；⑤液氮保藏法第22頁(yè)二、發(fā)酵工程技術(shù)基礎(chǔ)

發(fā)酵工程：?jiǎn)渭?xì)胞純培養(yǎng)工業(yè)化過(guò)程，以產(chǎn)生大量目物。

1．液體培養(yǎng)——深層發(fā)酵

2．固體培養(yǎng)——淺盤培養(yǎng)

發(fā)酵設(shè)備：空壓機(jī)、種子罐、發(fā)酵罐，蒸汽發(fā)生器、空氣過(guò)濾器、離心機(jī)及多種參數(shù)控制與檢測(cè)設(shè)備，以L-Lys生產(chǎn)設(shè)備為例，見圖1所示。

第23頁(yè)圖1L-Lys生產(chǎn)過(guò)程工藝設(shè)備圖

第24頁(yè)第二節(jié)生物藥品提取、分布、純化技術(shù)基礎(chǔ)一、生物材料選擇：1．生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜、周質(zhì)2．生物材料采集與質(zhì)控（1）品種判定；（2）避免污染與感染；（3）選擇富集目標(biāo)物材料；（4）冷凍保存第25頁(yè)

二、生物活性物質(zhì)提取，濃縮與干燥

1．提取辦法與優(yōu)化

（1）溶劑選擇

（2）添加劑①保護(hù)劑；②酶抑制劑

（3）提取條件①溫度；②pH；③鹽；④表面活性劑

HLB值可供選擇表面活性劑

（一般10～20為佳）

優(yōu)化：通過(guò)多因子、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)工藝條件

第26頁(yè)2．濃縮與干燥

（1）濃縮辦法：①鹽析；②有機(jī)溶劑沉淀；③超濾；④真空濃縮或薄膜濃縮；

⑤離心凍干

第27頁(yè)（2）干燥：①低溫真空干燥；②噴霧干燥；③冷凍干燥

第28頁(yè)第29頁(yè)三、分離純化辦法：含量低、易變性、步驟多、多維組合，逐層分離（1）粗品分離：鹽析，分級(jí)沉淀，萃取，超濾（2）分離純化：多種色譜層析法（3）精制：親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC，電泳或等電聚焦四、分離純化原理：1．根據(jù)分子極性與溶解度大小2．根據(jù)分子形狀與分子大小3．根據(jù)電荷差異4．根據(jù)吸附特性5．根據(jù)生物配基特性第30頁(yè)第三節(jié)生物技術(shù)藥品制造技術(shù)基礎(chǔ)

Basisofbiotechdrugpharmaceuticaltechnolog一、基因工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)（一）重組DNA技術(shù)基本原理基因工程是通過(guò)體外重組將甲生物基因轉(zhuǎn)入乙受體生物內(nèi)進(jìn)行體現(xiàn)生物技術(shù)，包括6個(gè)主要過(guò)程：（1）取得目標(biāo)基因；（2）構(gòu)建DNA重組體；（3）將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞；（4）目標(biāo)基因克隆與判定；（5）目標(biāo)基因擴(kuò)增與目標(biāo)蛋白體現(xiàn)。（6）目標(biāo)蛋白純化與制劑第31頁(yè)

2．基因工程藥品制造過(guò)程

第32頁(yè)轉(zhuǎn)化獲得目基因→構(gòu)建重組體→構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞）→克隆與鑒定

Upstream→擴(kuò)大工程菌培養(yǎng)（或細(xì)胞）→純化目蛋白→除菌過(guò)濾→半成品檢定→制劑→成品檢定→包裝

Downstream第33頁(yè)二、基因工程制藥主要操作技術(shù)

（二）基因工程制藥操作技術(shù)1．目標(biāo)基因取得（1）逆轉(zhuǎn)錄法：真核基因轉(zhuǎn)錄hmRNA在原核不能直接體現(xiàn)（隱具有內(nèi)函子），在原核中缺乏hmRNA后加工系統(tǒng)，故不能成為成熟hmRNA,故要先純化目標(biāo)mRNA，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄作用下合成SSDNA(SiglestranDNA)。①cDNA第一鏈合成:以目標(biāo)mRNA為模板（3’-poly…AAA）,以oliger-dT為引物，加入dNTP,在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成SSDNA(SiglestranDNA).②cDNA第二鏈合成:先用堿或RNaseH水解除去與SSDNA配正確mRNA得到cDNA第一鏈，作為合成cDNA第二鏈模板，在DNA聚合Ⅰ（klenow片斷）作用下，加入dNTP,從5’→3’合成帶有發(fā)夾構(gòu)造U型DNA，以核酸酶S1切除U型構(gòu)造，形成雙鏈DNAdsDNA(cDNA)。第34頁(yè)圖5目標(biāo)基因取得第35頁(yè)（2）通過(guò)PCR技術(shù)制備目標(biāo)基因PCR（polymerosechainreaction）典型反應(yīng)包括①模板變性94℃以上（1～2′）(使DNA拆為單鏈)②退火50～55℃（1～2′）(使引物與模板配對(duì))③延伸72℃（1～2′）由高溫聚合酶催化從5’→3’延伸鏈長(zhǎng)。一般可通過(guò)30次循環(huán)，合成一定量cDNA,錯(cuò)誤率一般為0.25%。(擴(kuò)增>105倍)已有高溫DNA聚合酶，故操作已自動(dòng)化（PCR儀）（3）化學(xué)合成法在已知DNA序列或多肽一般構(gòu)造時(shí)，如鏈長(zhǎng)在60bp～100bp可用化學(xué)合成法直接合成DNA。第36頁(yè)2．DNA重組體構(gòu)建將目標(biāo)基因與基因載體連接，組成重組體基因載體（Vector）有（1）E.coli載體如PBR322（非體現(xiàn)型載體）體現(xiàn)型：PUC質(zhì)粒，PKK233-3，PET系統(tǒng)：PET28a，PET32（2）芽孢桿菌載體如PUB110pE194和pC194（3）鏈霉菌載體如PIJ101PSG5（4）λ噬菌體載體如λgt10(非體現(xiàn)型)λgt11(體現(xiàn)型)*非體現(xiàn)型用于構(gòu)建克隆基因擴(kuò)增與判定，體現(xiàn)型用于構(gòu)建生產(chǎn)目標(biāo)蛋白工程菌。一般目標(biāo)基因<10Kb，可選用質(zhì)粒為基因載體，目標(biāo)基因>10Kb，可選用λ噬菌體DNA為載體。第37頁(yè)cDNA與載體連接辦法

同聚尾連接法

用3’-脫氧核苷末端轉(zhuǎn)移酶，使cDNA與載體DNA3’末端帶上互補(bǔ)同型多聚體序列：

如質(zhì)粒-poly-C（或A）

cDNA-poly-G(或T)二者退火后，經(jīng)T4DNA連接酶封口，構(gòu)建重組體。3’脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶cDNAcDNA-polyA(C)dNTP載體DNA-polyT(G)②人工接頭連接法用T4DNA連接酶在平端上連接上人工接頭，再用工具酶切開成粘性末端。目基因 +cDNA接頭工具酶（內(nèi)限性內(nèi)切酶）第38頁(yè)3．重組體體現(xiàn)系統(tǒng)體現(xiàn)方式常用有①胞漿內(nèi)體現(xiàn)②分泌體現(xiàn)③周質(zhì)體現(xiàn)

（1）原核體現(xiàn)系統(tǒng)①E.coli；②芽孢桿菌Bacillus；③鏈霉菌StreptomycesE.coli體現(xiàn)系統(tǒng)長(zhǎng)處：①易大量生產(chǎn)，成本低，②周期短，相對(duì)較安全，已公認(rèn)可供大量生產(chǎn)。缺陷：①多為胞內(nèi)體現(xiàn)、純化困難，②易生成包括體，復(fù)性困難，③產(chǎn)物多為AuG(Met)起始密碼，④有內(nèi)毒素污染也許。第39頁(yè)（2）真核體現(xiàn)系統(tǒng)1）酵母屬單細(xì)胞真核生物非分泌型載體如PA815,PPIc2,分泌型PHIL-S1長(zhǎng)處：①易培養(yǎng)②無(wú)毒性③可分泌體現(xiàn)④產(chǎn)物可糖基化常用酵母體現(xiàn)體系①釀酒酵母（Saccharomycescoeviviae）體現(xiàn)，②畢赤酵母（pichiapsatoris）特點(diǎn)：①啟動(dòng)子為AOX1,屬乙醇氧化酶I基因,受甲醇誘導(dǎo)②易高密度發(fā)酵,達(dá)100g/L(10%)已成功用于體現(xiàn)INFα,乙肝表面抗原疫苗,Ins,Aibumin2）動(dòng)物細(xì)胞體現(xiàn)體系A(chǔ)哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO(病毒質(zhì)粒為載體)B昆蟲細(xì)胞——家蠶細(xì)胞,如生產(chǎn)INFα第40頁(yè)4．體現(xiàn)與體現(xiàn)產(chǎn)物純化（1）選擇高效體現(xiàn)工程菌，優(yōu)化發(fā)酵條件（培養(yǎng)基組成，接種量，溫度，溶氧，pH，誘導(dǎo)作用，發(fā)酵動(dòng)力學(xué)）進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵.（2）分離純化要求：①技術(shù)條件要溫和②選擇性要高③收率要高④步驟要少，時(shí)間短E純度>95%。第41頁(yè)體現(xiàn)產(chǎn)物流程

*inclusionbodies由體現(xiàn)產(chǎn)物重組蛋白,宿主蛋白和膜蛋白組成，以體現(xiàn)產(chǎn)物為主，其一級(jí)構(gòu)造正確，但空間構(gòu)造錯(cuò)誤，沒有活性，不溶于水，可低速離心搜集包涵體，用變性劑SDS尿素，鹽酸胍溶解，再稀釋透析除去變性劑，使其復(fù)性。第42頁(yè)為避免或減少包括體形成常用辦法：（1）減少培養(yǎng)溫度從37℃降到30℃可顯著減少包括體形成率。（2）以硫氧還原蛋白為載體進(jìn)行融合體現(xiàn)。硫氧還原蛋白是E.coil一種同源蛋白，定位于粘附區(qū)，富含-SH,可保目標(biāo)蛋白不發(fā)生分子錯(cuò)誤折疊，是一種熱穩(wěn)定蛋白，體現(xiàn)產(chǎn)物聚集于粘附區(qū)，通過(guò)振擾提取使產(chǎn)物進(jìn)入介質(zhì)中，再酶解就得到目標(biāo)蛋白。第43頁(yè)二、酶工程制藥技術(shù)基礎(chǔ)1、什么是酶工程（1）酶發(fā)覺，分離，純化與酶制劑工業(yè)化應(yīng)用。（2）酶與細(xì)胞固定化技術(shù)與酶反應(yīng)器。（3）生物酶工程：以基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究酶工程。（4）酶工程技術(shù)工業(yè)化應(yīng)用。2、長(zhǎng)處（1）固定化穩(wěn)定性提升（2）可反復(fù)使用，提升使用效率，減少成本（3）提升強(qiáng)度，便于連續(xù)化，自動(dòng)化，規(guī)模化生產(chǎn)（4）便于產(chǎn)物分離、純化第44頁(yè)3、制備辦法：吸附法，包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法、交聯(lián)法（1）包埋法：將酶或細(xì)胞定位于凝膠高聚物網(wǎng)絡(luò)中，如卡拉膠，海藻膠，聚丙烯酰胺如用卡拉膠固定L-蘋果酸合成酶生產(chǎn)L-蘋果酸，卡拉膠加水（加熱）溶解成5%（冷卻40℃）加入產(chǎn)酶菌體（攪拌均勻）冷卻（冷凍）切塊（1-2CM2）KCl固化裝柱（2）共價(jià)鍵結(jié)合法：酶分子與載體分子，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)使酶與載體共價(jià)結(jié)合，一般純酶固定化，用此法適用批量小，附加值高產(chǎn)品生產(chǎn)。如用CNBr活化纖維素載體再與酶蛋白共價(jià)結(jié)合。利用固定化胰蛋白酶親和層析制備胰蛋白酶抑制劑（3）交聯(lián)法：用雙功能試劑，將酶與載體交聯(lián)固定化如用二醛和明膠交聯(lián)固定化前列腺素合成酶合成PGE1，PGE2第45頁(yè)

4固定化酶性質(zhì)：（1）通過(guò)固定化酶活一般下降，因酶空間構(gòu)造發(fā)生變化，或酶與底物結(jié)合時(shí)有空間位阻，因此要測(cè)定固定化酶體現(xiàn)活力，再計(jì)算總活力，并與使用半衰期延長(zhǎng)時(shí)間，統(tǒng)計(jì)分析固定化工藝有效性（2）提升穩(wěn)定性，因固定化酶體現(xiàn)活力下降，但穩(wěn)定性提升，因此其穩(wěn)定性和測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)工藝效益十分主要，半衰期t1/2=0.693KDKD=2.303lg(ED)/(E)為起始活力，[E]為時(shí)間t后殘留活力。故經(jīng)常要研究E操作，儲(chǔ)存穩(wěn)定性或?qū)H對(duì)熱穩(wěn)定性和對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性。通過(guò)E一般能夠提升穩(wěn)定性（包括對(duì)溫度，pH，蛋白酶，變性劑和抑制劑耐受程度）因此有利工業(yè)化連續(xù)化與自動(dòng)化應(yīng)用。因此在生物工藝中就得到廣泛應(yīng)用。如制造r-氨基丁酸，天冬氨酸，L-蘋果酸，丙氨酸，色氨酸，苯丙氨酸等。還用于從丙烯氰生產(chǎn)丙烯酰胺第46頁(yè)

第四節(jié)生物制藥工藝中試放大設(shè)計(jì)

一、中試放大目標(biāo)與規(guī)模

1．目標(biāo)：（1）建立穩(wěn)定工藝、大批量制備足量合格產(chǎn)品，供應(yīng)臨床前與臨床研究；

（2）研究工藝參數(shù)制定工藝規(guī)程和檢定規(guī)程，為正式生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，確保能在后來(lái)生產(chǎn)中應(yīng)用。

二、規(guī)模：

中試是由小試轉(zhuǎn)入工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)渡性研究，是取得成功產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵。

第47頁(yè)三、中試放大特點(diǎn)1、改善小試操作，穩(wěn)定工藝2、提升收率，提升產(chǎn)品質(zhì)量3、減少消耗，確定原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)4、形成批量生產(chǎn)，制定制造規(guī)程和檢定規(guī)程四、中試放大時(shí)應(yīng)具有條件（1）有穩(wěn)定工藝：收率，質(zhì)量可靠（2）操作條件基本確立（3）已建立中間品和成品分析辦法（4）生物材料已判定（5）物料平衡、三廢處理已基本處理（6）中試規(guī)模、產(chǎn)品產(chǎn)量，規(guī)模已確定（7）安全生產(chǎn)已有方案第48頁(yè)五．中試放大要處理問(wèn)題（1）原輔材料規(guī)格（2）設(shè)備選型與材質(zhì)選用（3）反應(yīng)條件（4）原輔料中間品、產(chǎn)品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)與檢定辦法（5）下游工藝優(yōu)化與穩(wěn)定制造規(guī)程制定六