耐輻射球菌對(duì)鹽脅迫下油菜幼苗生長的影響

土壤鹽漬化改變了土壤結(jié)構(gòu)和功能，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球已有20%的耕地受到鹽分脅迫，并且每年以（1.5～2.0）×107hm2的速度增長，預(yù)計(jì)到2050年，將有50%耕地受到土壤鹽漬化的影響[2]。高鹽環(huán)境會(huì)使植物產(chǎn)生滲透脅迫、質(zhì)膜損傷、離子不平衡等問題，從而抑制植物的生長發(fā)育[3]。通過接種耐鹽促生菌，可以緩解鹽脅迫危害，降低高鹽對(duì)植物的不利影響。耐鹽促生菌觸發(fā)植物耐鹽機(jī)制，可能是通過菌株分泌吲哚乙酸（IAA）、產(chǎn)鐵載體、ACC脫氨酶及溶磷解鉀等方式，進(jìn)而緩解植物鹽脅迫損害，維持植物正常生長[4]。耐輻射球菌（Deinococcusradiodurans，DR）能夠在干旱、強(qiáng)輻射、高鹽等極端環(huán)境中長期存活，得益于其強(qiáng)大的DNA損傷修復(fù)和氧自由基清除系統(tǒng)[5]，前期研究發(fā)現(xiàn)，耐輻射球菌中含有多個(gè)干燥、氧化等抗性相關(guān)蛋白，如IrrE、PprM等[6-7]，這些蛋白在油菜[6]、煙草[8]中能顯著提高底盤生物的耐鹽能力，然而耐輻射球菌直接與植物的互作增強(qiáng)抗逆性并未見報(bào)道。本研究以耐輻射球菌為供試菌株，甘藍(lán)型油菜為研究對(duì)象，探究耐輻射球菌對(duì)油菜幼苗生長的影響，以期為耐鹽微生物在鹽漬化土壤中的改良提供重要的菌種資源。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料供試甘藍(lán)型油菜種子由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；供試菌株耐輻射球菌（DR）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供，保存于本實(shí)驗(yàn)室。1.2試驗(yàn)方法1.2.1DR菌的促生特性分析。采用Salkowski比色法測定菌株產(chǎn)IAA能力，含有鉀長石的解鉀培養(yǎng)基檢測菌株解鉀能力，PKO培養(yǎng)基檢測菌株解無機(jī)磷能力，通過在ADF培養(yǎng)基上連續(xù)劃線5次分析菌株產(chǎn)ACC脫氨酶的能力[9]；利用CAS檢測液分析菌株產(chǎn)鐵載體能力[10]。1.2.2菌劑制備及盆栽試驗(yàn)。將DR菌接種于TGY培養(yǎng)基，于30℃、200r/min培養(yǎng)24h，4000r/min離心10min，去上清液，用無菌水懸浮，調(diào)節(jié)OD600至0.5作為浸種液。選擇籽粒飽滿、形狀均一的油菜種子，用乙醇和HgCl2消毒處理后，分別置于DR浸種液和無菌水中浸種1h，置于無菌環(huán)境中風(fēng)干備用，以浸泡無菌水的種子為對(duì)照組。采用溫室土培法，在盆中裝入泥炭土播種，每盆5粒，加入等量霍格蘭營養(yǎng)液，種子萌發(fā)期間澆無菌水維持濕度。待幼苗長至2葉1心時(shí)，每盆留2株，采用根灌方式加DR菌液，根際周圍加入5mL的處理菌液；待幼苗長至5葉1心時(shí)，進(jìn)行不同的鹽處理（0、100、200mmol/LNaCl）。處理15d后采集植株樣品，用于生長指標(biāo)和生理指標(biāo)的測定。1.2.3油菜生長指標(biāo)和理化指標(biāo)[11]的測定。油菜幼苗株高與根長用標(biāo)準(zhǔn)尺測量。采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定丙二醛（MDA）含量，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，NBT還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（CAT）活性，蒽酮法測定可溶性糖含量，酸性茚三酮法測定脯氨酸含量，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定可溶性蛋白質(zhì)。1.3數(shù)據(jù)分析采用Microsoft365MSO進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差分析與多重比較。2結(jié)果分析2.1DR菌的促生特性分析由表1可知，DR菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA能力，體系中IAA濃度可達(dá)18.81mg/L，但接種該菌的CAS檢測液沒有顏色變化，解鉀培養(yǎng)基和PKO培養(yǎng)基上沒有發(fā)現(xiàn)明顯的透明圈，ADF培養(yǎng)基中未出現(xiàn)劃線菌落，說明該菌不具有產(chǎn)鐵載體、解鉀、解無機(jī)磷以及產(chǎn)ACC脫氨酶能力。由此分析，DR菌僅具有產(chǎn)IAA能力。表1耐輻射球菌的促生特性分析2.2DR菌對(duì)鹽脅迫下油菜幼苗生長指標(biāo)的影響由圖1可知，鹽脅迫油菜幼苗15d后，非脅迫處理下接種DR菌的油菜幼苗株高、根長均高于對(duì)照組，分別提高71.89%、9.88%。鹽脅迫處理后，油菜幼苗的株高顯著降低，根長卻顯著增加；200mmol/L鹽脅迫后，與對(duì)照組相比，接種DR的油菜幼苗株高、根長分別增加32.39%、14.32%。說明接種DR菌可顯著提高油菜幼苗的生長狀況。圖1接種DR對(duì)不同鹽脅迫處理下油菜幼苗株高和根的影響2.3DR菌對(duì)鹽脅迫下油菜幼苗脂膜過氧化及抗氧化酶活性的影響由圖2可知，盆栽試驗(yàn)中非鹽脅迫條件下，對(duì)照和處理組的MDA含量均維持較低水平；但隨著鹽脅迫的增加，MDA含量逐漸增加。在100、200mmol/L鹽脅迫下，接種DR幼苗的MDA含量顯著低于對(duì)照組（分別降低19.63%和38.60%）。結(jié)果表明，在鹽脅迫下接種DR菌能緩解鹽脅迫對(duì)油菜幼苗造成的膜脂過氧化損害。圖2接種DR菌對(duì)不同鹽脅迫處理下油菜幼苗MDA含量的影響由圖3可知，在無鹽脅迫下，接種DR菌油菜幼苗的POD、SOD和CAT酶活性與對(duì)照組相比均有所增加，表明在沒有鹽脅迫下，接種DR菌能使3種抗氧化酶活性增加。在100、200mmol/L鹽脅迫下，接種DR菌的油菜苗抗氧化酶活性均高于對(duì)照組，尤其在200mmol/L鹽脅迫下，接種DR油菜幼苗的POD、SOD和CAT酶活分別提高461.04%、3.58%和30.98%。表明在鹽脅迫下，接種DR菌能提高油菜幼苗葉片的抗氧化酶活性，進(jìn)而清除鹽脅迫所產(chǎn)生的ROS，從而緩解鹽脅迫對(duì)油菜幼苗的損傷。圖3接種DR菌對(duì)不同鹽脅迫處理下油菜幼苗POD酶活、SOD酶活、CAT酶活的影響2.4DR菌對(duì)鹽脅迫下油菜幼苗小分子滲透保護(hù)物質(zhì)的影響鹽脅迫會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生滲透脅迫，而植物體可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等小分子物質(zhì)含量來抵御脅迫損傷。由圖4可知，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量變化趨勢相似，隨著鹽濃度的增加，這3種小分子物質(zhì)含量迅速增加；與對(duì)照組相比，在200mmol/L脅迫下，接種DR幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量分別增加39.78%、24.59%和5.05%。結(jié)果表明，接種耐輻射異常球菌可以提高油菜幼苗葉片內(nèi)的小分子物質(zhì)含量，從而緩解鹽脅迫對(duì)幼苗造成的脅迫損傷。圖4接種DR菌對(duì)不同鹽脅迫處理下油菜幼苗小分子滲透保護(hù)物質(zhì)含量的的影響3討論與結(jié)論土壤鹽漬化會(huì)抑制植物生長，降低作物生產(chǎn)力，是農(nóng)業(yè)面臨的一個(gè)重大難題。研究表明，利用耐鹽促生菌可以緩解鹽脅迫對(duì)農(nóng)作物的毒害[11]，耐輻射球菌DR能夠耐受2mol/LNaCl[12]，且該菌的全局調(diào)控因子IrrE轉(zhuǎn)入油菜[6]、煙草[8]等植物中均能提高底盤生物的耐鹽能力，同時(shí)該菌還存在與植物L(fēng)EA蛋白同源的DR1372、DR0105、DR1172等抗逆蛋白[5]，均可以作為耐輻射球菌作為潛在耐鹽促生菌的證據(jù)之一。本研究通過實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了耐輻射球菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA能力，這進(jìn)一步表明該菌具有促進(jìn)植物生長的可能性。研究表明，不同來源的耐鹽促生菌可以促進(jìn)植物生長、提高胞內(nèi)小分子滲透保護(hù)物質(zhì)等含量[13]。本研究中，鹽脅迫下接種DR的油菜株高、根長等指標(biāo)均高于對(duì)照組，這與Tiwari等[13]的研究結(jié)果類似。在植物細(xì)胞中，超氧化物歧化酶催化O2-歧化為氧氣和過氧化氫，過氧化氫酶催化過氧化氫生成水和氧氣，而過氧化物酶在清除脂肪酸β氧化過程中產(chǎn)生的過氧化物發(fā)揮重要作用[14]，3種抗氧化酶能夠迅速清除油菜因鹽脅迫而產(chǎn)生的過量ROS。本研究結(jié)果表明，在鹽脅迫條件下，接種耐輻射球菌有助于將這3種抗氧化酶的活性維持在較高的水平。可見，耐輻射球菌提高了油菜幼苗中的SOD、POD和CAT活性，鹽脅迫下ROS