天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座

第一節(jié)提取方法與技術(shù)

天然藥品化學(xué)研究是從有效成份或生理活性化合物提取、分離工作開始。在進(jìn)行提取之前，應(yīng)對所用藥材進(jìn)行以下考查：基源（學(xué)名）、產(chǎn)地、藥用部位、采集時(shí)間與方法。還要系統(tǒng)查閱文件，以充分了解和利用前人經(jīng)驗(yàn)。（同一品種其含成份含量因產(chǎn)地、取材部位、采集時(shí)間、存放條件不一樣而有改變）天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第1頁已知成份或已知化學(xué)結(jié)構(gòu)類型：普通先查閱相關(guān)資料,（工業(yè)生產(chǎn)中慣用）搜集比較各種提取方法為制訂研究工作方案提供依據(jù)。未知有效成份或有效部位：①依據(jù)預(yù)先確定目標(biāo)。（試驗(yàn)室慣用）②以適當(dāng)活性測試體系為指導(dǎo)。③提取、分離、動物模型篩選。④臨床驗(yàn)證。提取

天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第2頁中草藥有效成份提取

提取是研究天然產(chǎn)物一個(gè)主要步驟，慣用方法有溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法和升華法。水蒸氣蒸餾法：適合用于有揮發(fā)性能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞且難溶或不溶于水成份提取。比如揮發(fā)油類成份。升華法：適合用于含有升華性質(zhì)成份提取。比如樟腦、咖啡因等溶劑提取法:選擇適當(dāng)溶劑將中草藥中化學(xué)成份從藥材中提取出來。

天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第3頁1.概念：依據(jù)天然藥品中各種化學(xué)成份溶解性能，選擇對有效成份溶解度大而對其它成份溶解度小溶劑，用適當(dāng)方法將所需化學(xué)成份盡可能完全從藥材組織中溶解提出方法。溶劑提取過程是溶劑對藥材組織細(xì)胞不停作往返擴(kuò)散、滲透、溶解過程，直至藥材組織細(xì)胞內(nèi)外溶液中被溶解化學(xué)成份濃度達(dá)平衡為止。一、溶劑提取法天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第4頁2.溶劑提取法提取原理：依據(jù)化合物在極性相同溶劑中有很好溶解性即“相同者相溶”這一原理進(jìn)行。極性從低到高次序依次是：石油醚<二硫化碳<苯<無水乙醚<三氯甲烷<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<乙腈<水<吡啶3.溶劑極性與介電常數(shù)ε相關(guān)，介電常數(shù)越大，極性越大天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第5頁

化合物極性大小與分子結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，普通來說兩種基本母核相同成份，其分子中官能團(tuán)極性越大或極性基團(tuán)數(shù)目越多，則整個(gè)分子極性就越大表現(xiàn)親水性越強(qiáng)，分子非極性部分越大或碳鏈越長則極性越小，親脂性越強(qiáng)?；衔飿O性天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第6頁

天然產(chǎn)物極性大致可分為三類：極性（親水性）、非極性（親脂性）、中等極性（即親水又親脂）。

親脂性成份：萜類、甾體、脂環(huán)、芳香族成份，可選取氯仿、乙醚、石油醚等非極性溶劑。

親水性成份：糖苷、氨基酸等，可選取水、含水醇等極性溶劑。

酸性、堿性及兩性化合物：依據(jù)存在狀態(tài)（游離型或解離型）。可選取不一樣PH值溶劑。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第7頁

選擇溶劑標(biāo)準(zhǔn)：選擇適當(dāng)溶劑是提取步驟關(guān)鍵。主要依據(jù)溶劑極性、被分離成份性質(zhì)、共存其它成份（雜質(zhì)）性質(zhì)三個(gè)方面。

對于提取溶劑要求：①對所提取成份溶解度大，對雜質(zhì)溶解度小，或反之；②溶劑不能與所提取成份發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，若反應(yīng)應(yīng)該可逆；③要經(jīng)濟(jì)易得，含有一定安全性；④沸點(diǎn)適中、便于回收和重復(fù)使用。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第8頁⑴水親水性成份。有時(shí)為了增加一些成份溶解度，也常采取酸水及堿水作為提取溶劑。如：多數(shù)游離生物堿是親脂性化合物，不溶或難溶于水，但與酸結(jié)合成鹽后，能夠離子化，加強(qiáng)了極性，變?yōu)橛H水性物質(zhì)，所以通慣用酸水提取生物堿；對于有機(jī)酸、黃酮、蒽醌、內(nèi)酯、香豆素以及酚類成份，常采取堿水提取，可使成份易于溶出。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第9頁用水作溶劑提取存在一些問題：①易酶解苷類成份，且易霉壞變質(zhì)；②對于含果膠、黏液質(zhì)類成份較多中草藥，其水提取液常呈膠狀，極難過濾；③含淀粉多中草藥，沸水煎煮時(shí)，淀粉可被糊化，過濾困難，所以不宜磨成細(xì)粉水煎；④含皂苷成份較多中草藥，水提液在減壓濃縮時(shí)，常會產(chǎn)生大量泡沫，濃縮困難。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第10頁⑵親水性有機(jī)溶劑能與水混溶有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等。乙醇雖易燃，但毒性小，價(jià)格廉價(jià)，起源方便，有一定設(shè)備即可回收重復(fù)使用，且乙醇提取液不易發(fā)霉變質(zhì)。所以乙醇是試驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用范圍最廣一個(gè)溶劑。甲醇性質(zhì)雖和乙醇相同，但因?yàn)橛卸拘裕陨儆?。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第11頁⑶親脂性有機(jī)溶劑與水不能互溶有機(jī)溶劑，如石油醚、苯、氯仿、乙醚等。這些溶劑選擇性能強(qiáng)，不能或不輕易提出親水性雜質(zhì)，易提取親脂性物質(zhì)。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第12頁

這類溶劑易揮發(fā)，多易燃（氯仿除外），普通有毒，價(jià)格較貴，設(shè)備要求也較高，操作需要有通風(fēng)設(shè)備；透入植物組織能力較弱，往往需要長時(shí)間重復(fù)提取才能提取完全。藥材中水分存在，會降低這類溶劑穿透力，極難浸出其有效成份，影響提取率，所以對原料干燥程度要求較高。所以，在大量提取或工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，直接應(yīng)用這類溶劑有一定不足。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第13頁4.提取前預(yù)處理：通常粉碎成粗粉；種子類先脫脂；水溶性成份提取宜將藥材切成小段、薄片或粗粉；苷類要預(yù)防酶水解；苷元及次生苷要保留酶活性等等。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第14頁5.影響提取原因：（1）藥材粉碎度藥材粉碎得越細(xì)，中藥粉末表面積越大，提取效率高，但粉碎過細(xì)，則表面吸附作用也增強(qiáng)，反而影響擴(kuò)散速度，降低了提取效率，另首先，雜質(zhì)提取量也增高。普通情況下，用有機(jī)溶劑提取時(shí)，以過20目篩為宜。用水提取時(shí)，則用粗粉或薄片。溶劑提取法關(guān)鍵是選擇適當(dāng)溶劑和提取方法，但在操作過程中，還受其它原因影響。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第15頁（2）溫度

普通來講，熱提取效率高，但雜質(zhì)多，冷提雜質(zhì)少，效率低。加熱溫度不宜超出100℃。在50～60℃條件下進(jìn)行提取保持很好提取率，又不使過多雜質(zhì)溶出。（3）時(shí)間和提取次數(shù)

藥材中有效成份伴隨提取時(shí)間延長而出量增大，直到藥材細(xì)胞內(nèi)外有效成份濃度到達(dá)平衡為止。普通情況下，用水加熱煮時(shí)以每次1～2小時(shí)為宜，進(jìn)行2～3次。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第16頁6.提取方法

慣用提取法有浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法。

(1)浸漬法此法適合用于有效成份遇熱易揮發(fā)和易破壞中草藥提取。按溶劑溫度分為熱浸、溫浸、冷浸等。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第17頁操作：現(xiàn)將中草藥粉或碎片裝入適當(dāng)容器中，然后加入適宜溶劑，浸漬藥材以溶出其中有效成份。特點(diǎn)：簡單易行，但提出率較低。最好采取二次、三次浸漬，以降低損失，提升提取率。假如溶劑為水話，需加入適當(dāng)防腐劑。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第18頁(2)滲漉法操作：將中草藥粉末裝在滲漉器中使藥材浸漬24~48小時(shí)膨脹，然后不停添加新溶劑，使其自上而下滲過藥粉，從滲漉筒下端出口流出、搜集浸出液。當(dāng)溶劑滲進(jìn)藥粉溶出成份比重加大而向下移動時(shí)，上層溶液或稀浸液便置換其位置，造成良好濃度差，使擴(kuò)散能很好地進(jìn)行，故浸出效率較高，當(dāng)浸出液很淺時(shí)提取基本完全。但溶劑消耗量大、費(fèi)時(shí)長。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第19頁滲漉裝置天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第20頁(3)煎煮法操作：將中藥粗粉加水加熱（加熱時(shí)最好時(shí)常攪拌，以免局部藥材受熱輕易焦糊）煮沸，將中藥成份提取出來。普通藥材易煎2次。所用容器普通為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿，不宜用鐵鍋，以免藥液變色。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第21頁特點(diǎn)：此法簡便，能煎出大部分有效成份，但煎出液中雜質(zhì)較多，且輕易發(fā)生霉變，一些不耐熱揮發(fā)性成份易損失。所以含揮發(fā)性成份及有效成份遇熱易破壞中藥不宜用此法，對含有多糖類中藥，煎煮后，藥液比較粘稠，過濾比較困難。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第22頁(4)回流提取法如用易揮發(fā)有機(jī)溶劑加熱提取中藥成份時(shí)，則需采取回流提取法以降低溶劑消耗，提升浸出效率。但受熱易破壞成份不宜用此法，且溶劑消耗量仍大，操作亦麻煩。此法提取效率較冷浸法高，不過因?yàn)椴僮鞑蛔?，大量生產(chǎn)中多采取連續(xù)提取法。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第23頁（5）連續(xù)提取法：為了填補(bǔ)回流提取法中需要溶劑量大、操作較煩不足，可采取連續(xù)提取法。試驗(yàn)室慣用索氏提取器。此法需要溶劑量較少，提取成份也比較完全，但普通需數(shù)小時(shí)（提取液受熱時(shí)間長）才能完成，所以對熱不穩(wěn)定易改變成份不宜用此法。盡管如此，在應(yīng)用揮發(fā)性有機(jī)溶劑提取時(shí)，不論小型試驗(yàn)或大型生產(chǎn)均以連續(xù)提取法為好。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第24頁索氏提取器天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第25頁(6)超聲提取技術(shù)

利用超聲波空化作用，破壞植物藥材細(xì)胞，使溶劑易于滲透細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)超聲波強(qiáng)烈震動能傳遞巨大能量給浸提藥材和溶劑，使他們做高速運(yùn)動，加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴(kuò)散和溶解，加速有效成份浸出，極大地提升提取效率。超聲波在傳遞過程中形成許多小空穴，這些小空穴瞬間閉合，可形成幾千個(gè)大氣壓壓力，同時(shí)局部溫度可到達(dá)千度以上，這種現(xiàn)象叫做空化天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第26頁無需高溫。適合用于熱不穩(wěn)定。常壓提取，安全性好，操作簡單易行，維護(hù)保養(yǎng)方便。提取效率高。適用性廣，絕大多數(shù)中藥材各類成份均可超聲提取。提取工藝成本低，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著。特點(diǎn)操作將藥材粉末置適宜容器內(nèi)，加入定量溶劑，密閉后置于超聲波提取器，選擇適當(dāng)超聲頻率提取一段時(shí)間。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第27頁（一）水蒸氣蒸餾法：是將含有揮發(fā)性成份藥材與水共蒸餾，使揮發(fā)性成份隨水蒸氣一并餾出，經(jīng)冷凝分取揮發(fā)性成份浸提方法。當(dāng)餾出液由渾濁變?yōu)槌吻鍟r(shí)，表示蒸餾已基本完成。該法適合用于含有揮發(fā)性、難容或不溶于水、與水不會發(fā)生反應(yīng)、能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞中草藥成份提取。如，麻黃堿就能夠用此法直接從麻黃中蒸餾出來，這個(gè)方法主要用于揮發(fā)油二、其它提取方法天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第28頁天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第29頁(二)升華法有些固體物質(zhì)受熱后會直接汽化，遇冷后又凝固為原來固體化合物，該現(xiàn)象稱之為升華。對于含有升華性質(zhì)有效成份，可采取升華法提取。如從樟木中提取樟腦，從茶葉中提取咖啡堿。此法簡單易行，但在實(shí)際提取時(shí)極少采取。因?yàn)樯A所需溫度很高，中草藥輕易炭化，炭化后產(chǎn)生揮發(fā)性焦油狀物，輕易黏附在升華物上，不易精制除去；其次，升華不完全，產(chǎn)率低，有時(shí)還伴隨有分解現(xiàn)象。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第30頁天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第31頁超臨界流體：一物質(zhì)處于臨界溫度（Tc）與臨界壓力（Pc）以上狀態(tài)下，形成既非液體又非氣體單一相態(tài)時(shí)，稱為超臨界流體。

特點(diǎn)：流體密度近似液體，粘度于氣體相同，擴(kuò)散力比液體大，介電常數(shù)隨壓力增大而增加，滲透性優(yōu)于液體。比液體溶劑有更佳溶解力，有利于溶質(zhì)萃取。（三）超臨界流體萃取技術(shù)天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第32頁二氧化碳優(yōu)點(diǎn)：1）不殘留有機(jī)溶劑、萃取速度快、收率高，安全不易燃燒及化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。2）萃取溫度較低，適合用于對熱不穩(wěn)定物質(zhì)提取。3）萃取介質(zhì)溶解特征輕易改變，一定溫度下改變壓力。4）能夠加入夾帶劑，改變介質(zhì)極性。5）適于對極性較大和分子量較大物質(zhì)萃取。6）萃取介質(zhì)可循環(huán)利用，無毒，成本低。慣用作超臨界流體物質(zhì)：二氧化碳、氧化亞氮、乙烷、乙烯和甲苯等天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第33頁超臨界萃取不足：1）對脂溶性成份溶解能力強(qiáng)，對水溶性成份溶解能力弱。2）設(shè)備造價(jià)高，設(shè)備折舊費(fèi)百分比大。3）更換產(chǎn)品時(shí)清洗設(shè)備較困難。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第34頁提取天然藥品得到提取液是混合物，需要進(jìn)行深入分離與精制。去其糟粕，取其精華。1.溶解度差異：如結(jié)晶法、沉淀法等2.分配比不一樣：如萃取法3.吸附性差異：物理吸附、化學(xué)吸附及半化學(xué)吸附4.分子大小差異：透析法、凝膠濾過法、超濾法5.離解程度不一樣：離子交換法或電泳分離依據(jù)：共存成份性質(zhì)差異第二節(jié)分離精制和判定方法與技術(shù)天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第35頁1.系統(tǒng)溶劑提取法：是研究天然藥品成份初步提取分離方法。用極性從低到高溶劑依次提取。石油醚→油脂、蠟、葉綠素、揮發(fā)油、游離甾體及三萜類氯仿或醋酸乙酯→游離生物堿、有機(jī)酸及黃酮、香豆素苷元丙酮或乙醇、甲醇→苷類、生物堿鹽、鞣質(zhì)等水→氨基酸、糖類、無機(jī)鹽等本法缺點(diǎn)：因?yàn)楦鞒煞葜g助溶作用，同一類成份往往也會分散在鄰近幾個(gè)部位中。但系統(tǒng)溶劑法仍是研究成份不明天然藥品最慣用方法。一、依據(jù)物質(zhì)溶解度差異進(jìn)行分離天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第36頁2.結(jié)晶與重結(jié)晶法結(jié)晶和重結(jié)晶是利用固體混合物中各種成份在溶劑中溶解度差異，使所需成份以結(jié)晶狀態(tài)析出，到達(dá)分離精制目標(biāo)。結(jié)晶溶劑選擇：（1）不與結(jié)晶物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（2）對結(jié)晶物質(zhì)溶解度隨溫度不一樣有顯著差異，熱時(shí)溶解度大，冷時(shí)溶解度??；對可能存在雜質(zhì)溶解度非常大或非常小；（3）沸點(diǎn)適中，不宜過高或過低。慣用溶劑有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等。還可用兩種或兩種以上混合溶劑天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第37頁操作：在將被提取物晶體置于單口瓶中，加入較需要量稍少適宜溶劑，加熱到微微沸騰一段時(shí)間后，若未完全溶解，可再添加溶劑，每次加溶劑后需再加熱使溶液沸騰，直至被提取物晶體完全溶解（但應(yīng)注意，在補(bǔ)加溶劑后，發(fā)覺未溶解固體不降低，應(yīng)考慮是不溶性雜質(zhì)，此時(shí)就不要再補(bǔ)加溶劑，以免溶劑過量）。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第38頁溫度不一樣——溶解度差異結(jié)晶、重結(jié)晶待純化物A+雜質(zhì)B、C加MeOH熱溶熱濾殘?jiān)–）濾液（A+B）冷置析晶母液（B）結(jié)晶（A）天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第39頁3.沉淀法：在溶液中加入一些試劑或溶劑，使部分物質(zhì)沉淀析出，到達(dá)分離目標(biāo)。

解離型/離子態(tài)游離型/分子態(tài)H+BH+BOH-H+A-HAOH-脂溶性水溶性（1）酸堿沉淀法

經(jīng)過加入酸、堿以調(diào)整溶液PH值改變分子存在狀態(tài)，從而改變?nèi)芙舛榷竭_(dá)分離目標(biāo)。

天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第40頁A．酸/堿法（酸提取堿沉淀法）

——生物堿提取、純化H+BH+BOH-醇提物浸膏（B）藥渣酸水提取液稀酸水提?。˙H+

）堿化沉淀（B）堿水液（水溶性雜質(zhì)）（脂溶性雜質(zhì)）天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第41頁藥材（HA）藥渣堿水提取液堿水提?。ˋ-

）酸化沉淀（HA）酸水液（水溶性雜質(zhì)）（脂溶性雜質(zhì)）B．堿/酸法（堿提取酸沉淀法）

——黃酮、蒽醌等酚性成份提取、純化H+A-HAOH-天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第42頁（2）試劑沉淀法利用成份能與一些試劑產(chǎn)生沉淀，或利用一些成份在不一樣溶劑中溶解度差異，經(jīng)過加入特定試劑或溶劑使生成沉淀，到達(dá)分離目標(biāo)。比如：酸性化合物與鈣、鋇、鉛等生成水不溶性鹽產(chǎn)生沉淀。生物堿與苦味酸、磷鉬酸等生物堿沉淀劑形成水不溶性鹽沉淀；雷氏銨鹽與季銨堿生成生物堿雷氏銨鹽沉淀；膽固醇與甾體皂苷生成沉淀；蛋白質(zhì)與鞣質(zhì)形成沉淀等天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第43頁A.水/醇法—除去多糖、蛋白質(zhì)、淀粉、無機(jī)鹽等水溶性雜質(zhì)。B.醇/水法—除去脂溶性油脂、樹脂、葉綠素等水不溶性雜質(zhì)。C.醇/乙醚（丙酮）法—因皂苷類在醇中溶解度大，而在乙醚中溶解度小沉淀析出。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第44頁A．水/醇法——除去水提液中水溶性雜質(zhì)中藥水提取液加數(shù)倍量濃醇靜置過夜母液（目標(biāo)成份）沉淀（水溶性雜質(zhì)）（如蛋白質(zhì)、多糖、果膠、粘液質(zhì)）天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第45頁B．醇/水法：除去醇提液中脂溶性雜質(zhì)中藥醇提取液加數(shù)倍水靜置過夜母液（目標(biāo)成份）沉淀（脂溶性雜質(zhì)）（如油脂、葉綠素等）天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第46頁C．醇/醚法（醇/丙酮法）：純化皂苷皂苷醇溶液加數(shù)倍量乙醚，靜置母液（脂溶液雜質(zhì)）沉淀（皂苷）天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第47頁二、依據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中分配比不一樣進(jìn)行分離

常見有簡單液-液萃取法、逆流分溶法（CCD）、液滴逆流色譜（DCCC）、高速逆流色譜（HSCCC）、液液分配色譜（LC/LLC）、紙色譜（PC）等。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第48頁1.液-液萃取與分配系數(shù)K值原理：利用混合物中各成份在兩種互不相溶溶劑中分配系數(shù)不一樣而到達(dá)分離目標(biāo)。依據(jù)分配定律，化合物在一定溫度和壓力下，溶解在兩個(gè)同時(shí)存在互不相溶溶劑里，到達(dá)平衡后，該化合物在兩相中濃度比是一個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)K值。

K=CU/CLCU表示溶質(zhì)在上相溶劑中濃度；CL表示溶質(zhì)在下相溶劑中濃度（一）兩相溶劑萃取法提取液中加入一個(gè)與其互不相溶溶劑配成兩相溶劑系統(tǒng)，利用混合物中各種成份分配系數(shù)差異進(jìn)行分離天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第49頁

各成份在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率就越高。K=CU/CL

舉例：A、B兩種溶質(zhì)在CHCl3/H2O中進(jìn)行分配，如A、B均為1克，KA=10，KB=0.1，兩相溶劑體積比為VCHCl3/VH2O=1，在分液漏斗中作一次振搖分配平衡后，90%以上溶質(zhì)A將分配在上相溶劑（水）中，不到10%A分配到下相溶劑（氯仿）中。一樣道理，溶質(zhì)B分配將與A相反。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第50頁

定義：分離因子可定義為A、B兩種溶質(zhì)在同一溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)比值。如上例，則其分離因子β=KA/KB，即KA=10；KB=0.1；

β=KA/KB=10/0.1=100

普通，β≥100時(shí)，僅作一次簡單萃取就可實(shí)現(xiàn)基本分離；但100>β≥10時(shí),則須萃取10-12次；β≤2時(shí)，要想實(shí)現(xiàn)基本分離，須作100次以上萃取才能夠。β≈1時(shí)，則KA≈KB。意味著二者性質(zhì)極其相近，用分配無法實(shí)現(xiàn)分離。2.分離難易與分離因子β天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第51頁3.逆流連續(xù)萃取法：是一個(gè)連續(xù)兩相溶劑萃取法。其裝置可含有一根、數(shù)根或更多萃取管。利用兩種互不相溶溶劑相對密度不一樣，使相對密度小相液作為流動相，逆流連續(xù)穿過相對密度大作為固定相相液，借以交換溶質(zhì)而到達(dá)分離目標(biāo)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，萃取較完全，防止乳化。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第52頁4.逆流分溶法（CCD）此法相當(dāng)于屢次萃取。在No.0漏斗中溶入溶質(zhì)并加入流動相。振搖使兩相溶劑充分混合，靜置分層后，分出流動相，令其移入No.1管，再在No.0管中補(bǔ)加新鮮流動相，再次振搖混合，靜置分層并進(jìn)行轉(zhuǎn)移。如此連續(xù)不停地操作下去，溶質(zhì)即在兩相溶劑中，不停地重新分配并到達(dá)分離目標(biāo)。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第53頁流動相液滴垂直上下，經(jīng)過固定相液

5.液滴逆流色譜（DCCC）天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第54頁6.紙色譜法以濾紙為支持劑，濾紙上吸著水為固定相，用一定溶劑系統(tǒng)為移動相進(jìn)行展開，利用混合物中各成份分配系數(shù)差異到達(dá)分離目標(biāo)。紙色譜原理與液-液萃取基本相同。

操作技術(shù)點(diǎn)樣：點(diǎn)樣量普通為幾毫克至幾十毫克，點(diǎn)樣量大則點(diǎn)樣原點(diǎn)宜大些。展開：上行法或圓形法顯色：先在日光或紫外燈下觀察有沒有顏色或熒光，再噴灑對應(yīng)顯色劑。計(jì)算比移值（Rf）：原點(diǎn)至色譜斑點(diǎn)中心距離/原點(diǎn)至溶劑前沿距離天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第55頁7.液-液分配柱色譜固定相涂覆于硅膠等多孔載體上，裝柱流動相經(jīng)過色譜柱進(jìn)行洗脫物質(zhì)在兩相溶劑中作逆流分布

——分配系數(shù)不一樣，被洗脫速度不一樣原理：天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第56頁慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第57頁載體：有硅膠、硅藻上、纖維素粉正相色譜：固定相：水、緩沖液流動相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇※適合分離水溶性或中等極性成份：生物堿類、苷類、糖、有機(jī)酸。用流動相洗脫時(shí)，極性小成份先被洗脫。反相色譜：固定相：石油醚、異三十烷、石蠟油流動相：水、甲醇※適合分離脂溶性化合物：高級脂肪酸、油脂、游離甾體。當(dāng)用流動相洗脫時(shí)，極性大成份先被洗下來。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第58頁加壓液相柱色譜為了提升分液速度，縮短分離時(shí)間，在加壓條件下進(jìn)行分離，加壓液相色譜用載體多為顆粒直徑很小，機(jī)械強(qiáng)度與比表面積比普通色譜用硅膠大球形微粒，按所加壓力不一樣可分為：

快速色譜（FLC）2個(gè)氣壓，分離范圍10mg-g

低壓液相色譜(LPLC)<5個(gè)氣壓，分離范圍10mg-1g

中壓液相色譜(MPLC)5-20個(gè)氣壓，分離范圍100mg-g高壓液相色譜(HPLC)>20個(gè)氣壓，分析型:分離范圍ug-10mg制備型:分離范圍mg-g天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第59頁天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第60頁分餾法：利用各沸點(diǎn)不一樣化合物，在分餾過程中產(chǎn)生高低不一樣蒸氣壓，從而搜集到不一樣沸點(diǎn)溫度餾分到達(dá)分離目標(biāo)。三、依據(jù)物質(zhì)沸點(diǎn)不一樣進(jìn)行分離天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第61頁四、依據(jù)物質(zhì)吸附性差異進(jìn)行分離

原理：利用混合物中各成份對吸附劑吸附能力不一樣而到達(dá)分離，其中固-液吸附用得最多，分為物理吸附，化學(xué)吸附及半化學(xué)吸附。物理吸附：分子間力，無選擇性，可逆。硅膠、氧化鋁、活性炭化學(xué)吸附：化學(xué)鍵，選擇性較強(qiáng)，常不可逆。硅膠——生物堿堿性氧化鋁——黃酮、蒽醌等半化學(xué)吸附：氫鍵，選擇性較弱，多可逆聚酰胺天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第62頁1.物理吸附基本規(guī)律——相同者易于吸附

吸附過程中三大要素：吸附劑、溶質(zhì)、溶劑非極性吸附劑：活性炭對非極性成份吸附強(qiáng)溶劑極性

吸附劑對溶質(zhì)吸附力

溶質(zhì)易被極性弱溶劑洗脫極性吸附劑：硅膠、氧化鋁對極性物質(zhì)親和力強(qiáng)溶劑極性

吸附劑對溶質(zhì)吸附力

溶質(zhì)易被極性強(qiáng)溶劑洗脫天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第63頁慣用吸附劑氧化鋁、硅膠、硅藻土、氧化鎂、碳酸鈣、活性炭等。（1）硅膠：為一多孔性物質(zhì)，可用通式SiO2·χH2O表示。它含有多孔性硅氧環(huán)，SiOSi交鍵結(jié)構(gòu)，因?yàn)槠涔羌鼙砻婧泻芏嘤坞x、鍵合和鍵合－活性狀態(tài)硅醇基。它能夠經(jīng)過氫鍵與極性或不飽和分子相互作用，同時(shí)能吸附多量水分。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第64頁

硅膠含水量與活性關(guān)系活性加入水量（%）

I0II5III15IV25V38活化：100-110oC30min天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第65頁（2）

氧化鋁：是一個(gè)吸附力很強(qiáng)親水性吸附劑，有酸性、堿性和中性三種規(guī)格。其吸附活性也與含水量相關(guān)氧化鋁含水量與活性比較活性加入水量（%）

Ⅰ0Ⅱ3Ⅲ6Ⅳ10Ⅴ15天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第66頁活性炭吸附法結(jié)晶、重結(jié)晶中脫色、脫臭從大量稀水液中濃縮微量物質(zhì)（3）活性炭簡單吸附法用于物質(zhì)濃縮與精制天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第67頁（4）

吸附柱色譜用于物質(zhì)分離在實(shí)際工作中硅膠與氧化鋁柱色譜用最多。

天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第68頁吸附劑與樣品量百分比：30～60：1

極性小，難以分離樣品：100～200：1

色譜柱長度與內(nèi)徑百分比：15～20：1

吸附劑粒度：100目，難以分離樣品可采取200～300目。粒度太細(xì)，譜帶輕易擴(kuò)散，可采取加壓色譜。操作時(shí)需要注意問題天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第69頁樣品與吸附劑裝柱吸附劑選取極性小溶劑裝柱，樣品一樣以濕法裝柱。假如樣品在極性小溶劑中溶解度小，則改用極性大溶劑溶解后，再用不到裝柱量1/20吸附劑拌勻，于60℃下加熱揮散溶劑，研細(xì)后再小心鋪在吸附劑柱上。洗脫用溶劑極性應(yīng)逐步增加往往采取梯度洗脫，實(shí)踐中多用混合溶劑，普通混合溶劑中強(qiáng)極性溶劑影響比較大。不可隨意將極性差異很大兩種溶劑混合使用。對于極性較大成份慣用氯仿-甲醇，按不一樣百分比梯度洗脫，對比較輕易洗脫極性小成份，可用氯仿-乙醚或氯仿-乙酸乙酯。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第70頁為防止發(fā)生化學(xué)吸附：酸性物質(zhì)分離選取硅膠、堿性物質(zhì)分離則選取氧化鋁為好。堿性物質(zhì)用硅膠分離時(shí)：在洗脫溶劑中加入堿性物質(zhì)（氨、吡啶、二乙胺等）；酸性物質(zhì)用氧化鋁分離時(shí)：洗脫劑中加入醋酸等。經(jīng)過TLC進(jìn)行篩選溶劑系統(tǒng)：在TLC展開時(shí)使組分Rf值到達(dá)0.2-0.3溶劑系統(tǒng)，為柱色譜最正確洗脫溶劑系統(tǒng)。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第71頁薄層層析是將作為固定相支持劑均勻地鋪在支持板（普通是玻璃板）上，成為薄層，把樣品點(diǎn)到薄層上，用適宜溶劑展開，從而使樣品各組分到達(dá)分離層析技術(shù)。假如支持劑是吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，則稱之為薄層吸附層析；假如支持劑是纖維素、硅藻土等，層析時(shí)主要依據(jù)是分配系數(shù)不一樣，則稱之為薄層分配層析；假如支持劑是離子交換劑，則稱為薄層離子交換層析；薄層若由凝膠過濾劑制成，則稱為薄層凝膠層析薄層層析天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第72頁薄層板制作支持板要表面平整、光滑，用前應(yīng)洗凈、干燥。慣用薄層板有硬板(濕板)與軟板(干板)之分。在支持劑中加入粘合劑(鍛石膏、淀粉等)，調(diào)成糊狀物所制成薄層板為硬板，用粉狀支持劑直接制成薄層板為軟板。硬板粘牢在支持板上，調(diào)成糊狀物噴顯色劑時(shí)不會沖散，可直立展開，而軟板只能近水平展開。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第73頁層析方法點(diǎn)樣距底邊1-1.5cm處，用毛細(xì)管點(diǎn)樣，直徑不超出2-3mm展開展式方式與紙層析一樣，有上行法、下行法等，但軟板薄層只能近水平展開（與水平成10o-20o）。吸附薄層層析所用展開劑主要是低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑，普通采取2-3種組分多元溶劑系統(tǒng)。展開劑選擇是依據(jù)被分離物極性、溶劑極性以及支持劑特征三方面來考慮。顯色：可先在日光下觀察，標(biāo)出眾斑并確定位置，然后在紫外燈下觀察和標(biāo)識，必要時(shí)在選擇顯色劑顯色觀察。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第74頁定性與定量分析薄層層析法用Rf值來表示被分離物質(zhì)在薄層上位置，與已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Rf對照，可進(jìn)行定性分析。定量分析時(shí)，可把斑點(diǎn)所在位置支持劑連同物質(zhì)一起刮下，然后用適當(dāng)溶液將其從支持劑上溶解下來，再測定其含量。用目測法比較樣品斑點(diǎn)和對照品斑點(diǎn)顏色深度和面積大小，或測量斑點(diǎn)面積，能夠進(jìn)行半定量分析和程度檢驗(yàn)，有條件時(shí)，可用薄層掃描儀進(jìn)行定量分析。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第75頁AB

ⅠCHCl3：MeOH(7:3)ⅡCHCl3：MeOH(3:7)吸附劑：硅膠天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第76頁2.半化學(xué)吸附---聚酰胺色譜

聚酰胺吸附色譜屬于氫鍵吸附。對于極性物質(zhì)和非極性物質(zhì)都適用，主要適合分離酚類、醌類、黃酮類化合物。聚酰胺性質(zhì)1.高分子聚合物2.不溶于水和慣用甲醇、乙醇、乙醚及丙酮等有機(jī)溶劑3.對堿穩(wěn)定4.對酸尤其是無機(jī)酸穩(wěn)定性差5.可溶于濃鹽酸、冰乙酸、甲酸天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第77頁聚酰胺吸附原理:氫鍵-半化學(xué)吸附因?yàn)榉肿又泻絮０肤驶坝坞x胺基，在水溶液中能與含有酚羥基以及羰基化合物經(jīng)過氫鍵結(jié)合而被吸附，從而與不含上述基團(tuán)化合物分離。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第78頁吸附規(guī)律：（含水溶劑中）①形成氫鍵基團(tuán)數(shù)目越多，吸附能力越強(qiáng)②易形成份子內(nèi)氫鍵者，吸附對應(yīng)減弱③分子中芳香化程度高，吸附作用增強(qiáng)

天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第79頁各種溶劑在聚酰胺柱上洗脫能力水甲醇乙醇?xì)溲趸c水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液化合物在不一樣溶劑中吸附力，隨溶劑極性增強(qiáng)而增強(qiáng)水中最強(qiáng)———常以水裝柱、樣品以水溶解上樣含水醇中次之醇中最弱———常以濃度漸高含水醇梯度洗脫

EtOH-H2O最慣用

弱強(qiáng)吸附規(guī)律：（含水溶劑中）天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第80頁

操作：用水裝柱,樣品也盡可能做成水溶液,使其充分被吸附,先用水洗,逐步提升醇濃度。各種溶劑在聚酰胺柱上洗脫能力為：水＜甲醇（乙醇）＜丙酮＜?xì)溲趸c水溶液＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺＜尿素水溶液聚酰胺色譜應(yīng)用：醌類、黃酮類等酚性制備和分離。脫鞣處理生物堿、萜類、甾類、糖類、氨基酸等極性與非極性化合物分離也有用途天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第81頁五、依據(jù)物質(zhì)分子大小差異進(jìn)行分離

天然有機(jī)物分子大小不一樣，表現(xiàn)出不一樣分子量，故能夠依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離。慣用方法有：

透析法:利用半透膜膜孔(透析袋、膀胱墨、火棉膠)

凝膠濾過法：利用凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

超濾法：利用分子大小不一樣引發(fā)擴(kuò)散速度差異。

超速離心法：利用溶質(zhì)在超速離心引發(fā)作用下含有不一樣沉降性或浮游性。

※以上方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白質(zhì)、核酸、多糖類脫鹽精制及分離工作。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第82頁1.透析法：透析法是利用小分子及小離子在溶液中可經(jīng)過半透膜而大分子及大離子不能經(jīng)過性質(zhì)，借以到達(dá)分離。如分離純化皂苷、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等成份時(shí)，即可用透析法除去小分子雜質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖、雙糖等。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第83頁2.凝膠濾過法（gelfiltration）原理：是利用分子篩分離物質(zhì)方法。所用載體葡聚糖凝膠在水中不溶解，但遇水后膨脹成含有三維空間結(jié)構(gòu)球形顆粒。因?yàn)槟z網(wǎng)孔半徑限制，大分子物質(zhì)不能滲透凝膠顆粒內(nèi)部，故只在顆粒間隙移動，并隨溶劑一起先從柱底流出，小分子因能自由地滲透到凝膠內(nèi)部，經(jīng)過色譜柱時(shí)阻力增大，流速變慢，后流出。樣品混合物中各個(gè)成份因分子大小各異，滲透凝膠顆粒內(nèi)部程度不一樣，按分子由大到小次序先后流出得以分離。天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第84頁凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分子篩作用按分子量由大到小次序分離天然藥物化學(xué)天然藥物化學(xué)成分提取分離和鑒定的方法和技術(shù)專家講座第85頁凝膠種類與性質(zhì)

慣用有葡聚糖凝膠（Sephadex-G）和羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex-LH-20)。(1)Sephadex-G

由平均分子量一定葡聚糖與交聯(lián)劑（如環(huán)氧氯丙烷）交聯(lián)聚合而成，生成凝膠顆粒網(wǎng)孔大小取決于所用交聯(lián)劑數(shù)量及反應(yīng)條件。加入交聯(lián)劑數(shù)量越多，網(wǎng)孔越緊密，孔徑越小，交聯(lián)度越高，吸水膨脹也越小，反之，交聯(lián)度越低，網(wǎng)孔越稀疏，吸水后膨脹也越大。商品型號按交聯(lián)度大小分類，并以吸水