流式細(xì)胞術(shù)及其應(yīng)用課件

常用流式細(xì)胞技術(shù)

常用流式細(xì)胞技術(shù)

1一、

流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)（FCM）就是對在高速流動的鞘液包括下的細(xì)胞、粒子進(jìn)行分析和分選的技術(shù)，這種細(xì)胞或粒子是經(jīng)過特異熒光標(biāo)記的。其特點(diǎn)是測量速度快，每秒鐘能測數(shù)千個(gè)乃至上萬個(gè)細(xì)胞，且可進(jìn)行多參數(shù)測量，另一特點(diǎn)是在分析的同時(shí)可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來，這就是分選技術(shù)。FCM(FlowCytomytry流式細(xì)胞術(shù))FCM(FlowCytomyter流式細(xì)胞儀)一、

流式細(xì)胞術(shù)的概念2

二、流式細(xì)胞儀的工作原理待測細(xì)胞被制成單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在清潔氣體的壓力下進(jìn)入流動室。流動室內(nèi)充滿鞘液，鞘液的作用有二：一是約束樣品使之在噴嘴中心以提高測量精度；二是防止樣品靠近噴孔壁以避免堵塞噴孔。在這種約束作用下，細(xì)胞排成單列一個(gè)跟隨一個(gè)地在鞘液包括下由流動室下面的噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。液柱與入射的高度聚焦的激光束相交，此時(shí)，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光。在與入射激光和液柱都垂直的方向設(shè)置有熒光測量系統(tǒng)，包括透鏡、光闌、濾片、檢測器等，將細(xì)胞的熒光信號變成電信號輸出到計(jì)算機(jī)，用專用軟件進(jìn)行分析。二、流式細(xì)胞儀的工作原理3美國B-D公司型號：FACSCalibur,單激光配制操作系統(tǒng)：MacOS8.51999年3月購置美國B-D公司4三、

流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù)

1前向角散射（FSC）：前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，也就是說，同一個(gè)細(xì)胞群體，F(xiàn)SC強(qiáng)的，其細(xì)胞大一些，而FSC弱的，其細(xì)胞小一些。2側(cè)向角散射（SSC）：側(cè)向角散射又稱90°散射或大角散射。側(cè)向角散射光對細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，對胞內(nèi)較大的顆粒也會有反應(yīng)。所以，側(cè)向角散射光的強(qiáng)弱可反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒的性質(zhì)。三、流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù)

53熒光強(qiáng)度（FL）：是細(xì)胞或細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。通過熒光強(qiáng)度可將同一個(gè)細(xì)胞群體中的有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的細(xì)胞區(qū)分開來，也就是我們通常所說的陽性細(xì)胞，也可以將陽性細(xì)胞中的高FL的細(xì)胞與低FL的細(xì)胞區(qū)分開來，也就是可以把強(qiáng)陽性細(xì)胞和弱陽性細(xì)胞區(qū)分開來。一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有三個(gè)激光光源（488nm、633nm和407nm），可測出13個(gè)FL。3熒光強(qiáng)度（FL）：是細(xì)胞或細(xì)胞上6四、

流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

1細(xì)胞DNA含量檢測：細(xì)胞固定后用PI染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個(gè)原理，并通過專用的DNA分析軟件，可測出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測。

四、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用

1細(xì)胞DNA含量檢測：7腫瘤診斷：

DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個(gè)重要標(biāo)志，細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征。因此，臨床上可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷、交界性腫瘤診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷等各方面。腫瘤診斷：8腫瘤預(yù)后估計(jì)：異倍體腫瘤惡性度、復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和死亡率都較二倍體腫瘤高。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺、結(jié)腸、直腸、前列腺和膀胱腫瘤中，異倍體和較高的S期百分比都是不良預(yù)后的標(biāo)志。同樣的，在肺癌、頭頸部腫瘤、卵巢癌、腎癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有類似發(fā)現(xiàn)。因此在病理組織學(xué)分級、臨床分期等指標(biāo)基礎(chǔ)上，用流式細(xì)胞儀檢測腫瘤DNA倍體能更客觀地預(yù)測預(yù)后。腫瘤預(yù)后估計(jì)：9凋亡：由于凋亡細(xì)胞核酸內(nèi)切酶活化，DNA降解，細(xì)胞DNA減少，因而可在G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，也就是凋亡峰。檢測調(diào)亡，可進(jìn)行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細(xì)胞的損傷機(jī)理的研究。凋亡：10細(xì)胞表型的分析得益于單克隆抗體的產(chǎn)生及發(fā)展，現(xiàn)在CD系統(tǒng)已有247種之多。細(xì)胞用帶有熒光的單克隆抗體標(biāo)記后，用流式細(xì)胞儀可對其進(jìn)行檢測分析，可分析出熒光細(xì)胞的含量，也可分析出這種陽性細(xì)胞的CD分子的相對含量。標(biāo)記的方法一般用直標(biāo)法，也可用間標(biāo)法。熒光探針多為FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、APC等。

2細(xì)胞表型分析：細(xì)胞表型的分析得益于單克隆抗體的產(chǎn)生及發(fā)展，11淋巴細(xì)胞分類：CD3(T細(xì)胞，CD4、CD8))、CD19（B細(xì)胞）、CD16、CD56（NK細(xì)胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。淋巴細(xì)胞分類：12造血干/祖細(xì)胞計(jì)數(shù)造血干/祖細(xì)胞存在于骨髓和外周血中，形態(tài)與淋巴細(xì)胞相似，用普通形態(tài)學(xué)方法難以識別。由于造血干/祖細(xì)胞表面可表達(dá)CD34和CD45抗原且具有很高的核酸含量，因而用CD34和CD45單克隆抗體和核酸染料進(jìn)行三色熒光標(biāo)記，F(xiàn)CM多參數(shù)分析血液、骨髓和濃縮白細(xì)胞懸液中造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量，對臨床血液病、惡性腫瘤、基因異常等疾病的造血干/祖細(xì)胞移植治療有十分重要的意義。造血干/祖細(xì)胞計(jì)數(shù)13白血病的免疫分型

流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型時(shí)，測量細(xì)胞數(shù)一般在10000～50000細(xì)胞之間，而且快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研究等有重要價(jià)值。白血病的免疫分型14利用FCM可快速檢測白血病細(xì)胞所表達(dá)的分化抗原，并可做多色標(biāo)記分析，從而可對白血病細(xì)胞作多參數(shù)多抗原分析，使一些形態(tài)學(xué)檢測上難以解決的問題迎刃而解。例如造血干細(xì)胞表達(dá)CD34，髓系表達(dá)CD13、CD14，B細(xì)胞系表達(dá)CD10、CD19、CD20等，T細(xì)胞系表達(dá)CD2、CD3、CD5、CD7，可以測定出血球細(xì)胞表達(dá)各種抗原的情形，協(xié)助臨床鑒別診斷。流式細(xì)胞術(shù)及其應(yīng)用課件15細(xì)胞系的鑒定新建細(xì)胞系新建立的細(xì)胞系，進(jìn)行系列的表型分析，以確定此細(xì)胞系的表型。已有細(xì)胞系的表型分析對于已知細(xì)胞系，由于多次傳代和培養(yǎng)條件的改變，細(xì)胞遺傳信息可能會發(fā)生突變，對其進(jìn)行表型分析，以檢測該細(xì)胞系是否有變異。細(xì)胞系的鑒定新建細(xì)胞系163血小板功能分析與血小板病診斷原理血小板是由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生的無核細(xì)胞，正常靜止?fàn)顟B(tài)呈兩面微凸的圓盤狀，平均直徑2～3μm?；罨难“宄什灰?guī)則形狀，表面有大量星狀突起，彼此間常發(fā)生粘附、聚集。血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮功能的分子基礎(chǔ)。3血小板功能分析與血小板病診斷原理血小板是由17靜止與活化血小板膜糖蛋白分子的種類、含量、結(jié)構(gòu)、功能等顯著不同，一些血小板糖蛋白的分子缺陷常導(dǎo)致血小板止血功能的異常，某些糖蛋白分子在血小板膜上高表達(dá)又是血小板被活化的特異性分子標(biāo)志。當(dāng)血小板表面結(jié)合有自身抗體時(shí)常導(dǎo)致血小板減少。血小板的上述變化，通過用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，可以敏感、特異、快速的診斷血小板病。靜止與活化血小板膜糖蛋白分子的種類、含量、結(jié)18血小板檢測指標(biāo)：質(zhì)膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)顆粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP?；罨篻pⅡb/Ⅲa復(fù)合物—活化早期標(biāo)志物CD62P—活化后期的表面標(biāo)志血小板抗體（PAIgG）。網(wǎng)織血小板計(jì)數(shù)：常用染料為TO。血小板檢測指標(biāo)：19

應(yīng)用血小板無力癥診斷：CD41/CD61缺失或異常巨大血小板綜合征診斷：CD42a/CD42b缺失免疫性血小板減少性紫癜診斷：PAIgG血栓前狀態(tài)與血栓性疾病診斷：血小板活化異常應(yīng)用204紅細(xì)胞疾病診斷網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與應(yīng)用網(wǎng)織紅細(xì)胞是未完全成熟的紅細(xì)胞，胞漿中仍殘留有不同含量的RNA。RNA含量越高，網(wǎng)織紅細(xì)胞越幼稚，反之，則接近于成熟紅細(xì)胞。網(wǎng)織紅細(xì)胞是反映骨髓紅系造血的指針。用熒光染料噻唑橙(ThiazoleOrange，TO)可使活體網(wǎng)織紅細(xì)胞中RNA染色，用488nm激光激發(fā)后發(fā)射綠色熒光，F(xiàn)CM分析其熒光強(qiáng)度的大小可測量網(wǎng)織紅細(xì)胞的數(shù)量和RNA含量。主要用于貧血篩查。

睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)的診斷

紅細(xì)胞表面CD59缺失4紅細(xì)胞疾病診斷網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與應(yīng)用215細(xì)胞內(nèi)蛋白的分析：細(xì)胞破膜后將細(xì)胞內(nèi)某一蛋白成分進(jìn)行熒光標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測量分析，同表型分析一樣，可以測量出這種陽性細(xì)胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。并且，結(jié)合細(xì)胞表型分析，進(jìn)行多標(biāo)記和多參數(shù)分析，可以檢測出含這種蛋白的細(xì)胞是屬于哪一種表型的細(xì)胞。多用間標(biāo)法，熒光探針多為FITC。也可以與周期分析結(jié)合起來，分別分析蛋白陽性和蛋白陰性細(xì)胞的細(xì)胞周期，這在研究功能蛋白對周期的調(diào)控作用是非常有用的工具。5細(xì)胞內(nèi)蛋白的分析：細(xì)胞破膜后將細(xì)226可溶性蛋白的檢測：為最新發(fā)展起來的用于檢測可溶性蛋白的流式細(xì)胞技術(shù)(CBA)，是將待檢蛋白吸附到微球上，再與熒光探針結(jié)合，測定微球上這種蛋白的熒光強(qiáng)度，與已知微球的熒光強(qiáng)度相比較，求出待測蛋白的含量，分析軟件可自動給出相關(guān)方程。6可溶性蛋白的檢測：為最新發(fā)237分選：用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來，可用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少，臺式機(jī)一般分選速度為每少鐘300個(gè)細(xì)胞，而大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬個(gè)細(xì)胞，并可做到點(diǎn)對點(diǎn)分選。但分選速度也與細(xì)胞中目的細(xì)胞的百分率及細(xì)胞懸液的密度有關(guān)。

7分選：用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有24FCM的應(yīng)用，概括成一句話就是

凡是能被熒光素標(biāo)記的且這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)的細(xì)胞或顆粒，都可用流式細(xì)胞儀檢測。在生物檢測技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)多用的儀器。FCM的應(yīng)用，概括成一句話就是25縱觀歷史，幾乎沒有哪一門科學(xué)技術(shù)象流式細(xì)胞術(shù)這樣凝結(jié)了眾多不同學(xué)術(shù)背景、不同科研領(lǐng)域的科學(xué)家的心血。從流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)明、改進(jìn)，流式細(xì)胞儀的研制、革新，到今天的眾多應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，每一步都是諸如生物學(xué)、生物技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、電子工程學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、高等數(shù)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、有機(jī)化學(xué)和物理學(xué)等學(xué)科知識綜合運(yùn)用的結(jié)晶?？v觀歷史，幾乎沒有哪一門科學(xué)技術(shù)象流式細(xì)胞術(shù)這樣凝結(jié)26而現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)，更是由于結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)、定量細(xì)胞化學(xué)和定量熒光細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用，使其在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等眾多研究領(lǐng)域的應(yīng)用將會越來越廣泛。而現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)，更是由于結(jié)合了單克隆抗體技術(shù)、定量27五、流式樣品的制備中應(yīng)注意的幾個(gè)問題

㈠熒光素和抗體的選擇

⒈熒光素的選擇：現(xiàn)在國內(nèi)引進(jìn)的大多數(shù)流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源，即488nm光源，所以我們在選擇熒光素時(shí)要選擇能被488nm激光激發(fā)的熒光素，常用的熒光素有：①測細(xì)胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。②測細(xì)胞蛋白、抗體或抗原：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5、PerCP-CY5.5。③測細(xì)胞膜電位：Rh-123。④測鈣離子：Fluo-3。五、流式樣品的制備中應(yīng)注意的幾個(gè)問題㈠熒光素和抗體的選擇28⒉抗體的選擇：一定要選擇商業(yè)化的流式用單克隆抗體，此類抗體在制備過程中有嚴(yán)格的質(zhì)控，非特異熒光弱。最好用直標(biāo)抗體，如果是用間標(biāo)抗體，二抗的選擇更應(yīng)嚴(yán)格。⒉抗體的選擇：29㈡樣品的準(zhǔn)備評價(jià)一個(gè)樣品制備的優(yōu)劣，可有三個(gè)評價(jià)指標(biāo)，即①細(xì)胞的密度，不能低于1×106/ml；②非特異熒光，不超過1％；③細(xì)胞碎片和聚集體，不能出現(xiàn)肉眼可見的團(tuán)塊。㈡樣品的準(zhǔn)備評價(jià)一個(gè)樣品制備30流式細(xì)胞儀對一個(gè)樣品提供的結(jié)果是否可信，雖然與儀器操作者的水平有很大關(guān)系，但在很大程度上取決于樣品制備的優(yōu)劣。細(xì)胞密度太低，影響測試速度并造成測試參數(shù)調(diào)整的困難，尤其是在做DNA分析時(shí)，由于細(xì)胞太少，勢必要提高樣品的流速，人為地增大了G0/G1期的CV值，影響了結(jié)果的可靠性；非特異熒光強(qiáng)，則造成樣品結(jié)果的假陽性；聚集體增多，尤其是肉眼可見的細(xì)胞聚集體，可造成流式細(xì)胞儀進(jìn)樣針的阻塞，影響儀器的性能，碎片可干擾測試結(jié)果，造成結(jié)果分析的困難。

流式細(xì)胞儀對一個(gè)樣品提供的結(jié)果是否可信，雖然31流式樣品制備過程中常見的問題及解決對策常見問題原因解決對策細(xì)胞密度低制備過程中細(xì)胞損失增加離心時(shí)間、吸棄上清非特異熒光強(qiáng)抗體不純、死亡細(xì)胞多選擇純度高的抗體、用同型對照抗體或雙標(biāo)記排除非特異熒光碎片多細(xì)胞死亡、機(jī)械損傷在細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)測試、避免反復(fù)吹打細(xì)胞聚集消化不完全、酒精固定造成的細(xì)胞粘連徹底消化、在用酒精固定細(xì)胞時(shí)加入終濃度為1.5-3％的小牛血清熒光弱靈敏度不夠、抗體加入量不飽和、反應(yīng)時(shí)間短改用生物素-親和素、增加抗體用量、延長反應(yīng)時(shí)間測不出亞二倍體峰凋亡測試方法選擇不當(dāng)改用原位末端標(biāo)記或Annexin-V和PI雙標(biāo)記法流式樣品制備過程中常見的問題及解決對策32㈢樣品對照細(xì)胞的熒光有自發(fā)熒光、非特異熒光和特異熒光，并且流式細(xì)胞術(shù)提供的陽性細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度都是相對陰性細(xì)胞而言的，所以在樣品制備中樣品對照的設(shè)置至關(guān)重要。①在測DNA時(shí)，要設(shè)正常細(xì)胞對照，即不做任何干預(yù)的細(xì)胞對照。②在檢測細(xì)胞膜CD分子和細(xì)胞內(nèi)蛋白或細(xì)胞因子時(shí)，要設(shè)同型抗體對照，如果是雙標(biāo)記或三標(biāo)記檢測，還要設(shè)單標(biāo)記的陽性對照。㈢樣品對照33六、流式樣品的制備：

⒈細(xì)胞DNA分析：用本法可測定細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體和凋亡，在樣品制備中存在的問題主要是細(xì)胞的聚集和碎片，建議在固定細(xì)胞時(shí)加入1.5%-3%小牛血清。①培養(yǎng)的細(xì)胞系、體液中分離的有核細(xì)胞或分離的組織細(xì)胞約1×106，離心沉淀后用0.3ml含5%-10%小牛血清的PBS懸浮，移入預(yù)先加有0.7ml無水乙醇的EP管中，置-20℃固定細(xì)胞24小時(shí)以上（用本法制備的細(xì)胞可在-20℃保存一周甚至更長的時(shí)間）。在分析腫瘤細(xì)胞的倍體時(shí)，要同時(shí)加入PBMC作為內(nèi)參，PBMC與腫瘤細(xì)胞的比例為1:2）。六、流式樣品的制備：

⒈細(xì)胞DNA分析：34②3000rpm離心細(xì)胞1分鐘，吸棄上清，用1mlPBS重懸細(xì)胞，再離心洗滌細(xì)胞一次，吸棄上清，沉淀細(xì)胞用100μl1mg/mlRNaseA懸浮，37℃30min以消化RNA，再加入400μl50μg/mlPI，置暗處10min后上機(jī)檢測。③結(jié)果分析：流式報(bào)告中可給出G0/G1、S、G2/M各期細(xì)胞的百分比、凋亡百分比和細(xì)胞倍體。②3000rpm離心細(xì)胞1分鐘，吸棄35GFP/DNA雙參數(shù)分析

在分析轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白（GFP）的細(xì)胞的細(xì)胞周期時(shí)，用GFP/DNA雙標(biāo)記法分析GFP表達(dá)陽性細(xì)胞的細(xì)胞周期，以觀察基因表達(dá)蛋白對細(xì)胞周期的影響，是目前最好的技術(shù)方法。方法為先用0.5%多聚甲醛預(yù)固定細(xì)胞30-60分鐘，以保護(hù)GFP，防止其熒光的卒滅，再用70%乙醇固定。流式報(bào)告中可給出GFP陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的細(xì)胞周期、GFP的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)量。GFP/DNA雙參數(shù)分析在分析轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋36胞內(nèi)蛋白/DNA雙參數(shù)分析在分析胞內(nèi)（胞漿或胞核）蛋白與細(xì)胞周期的關(guān)系時(shí)，也可用間接免疫螢光法先標(biāo)記胞內(nèi)蛋白，再用PI標(biāo)記DNA。這種樣品需要先用乙醇固定細(xì)胞，用破膜劑打孔，以便抗體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶蛋白結(jié)合，再用螢光二抗標(biāo)記細(xì)胞。最后加入PI，上流式測試，分析方法與前述方法一樣。胞內(nèi)蛋白/DNA雙參數(shù)分析在分析胞內(nèi)（胞漿或37⒉細(xì)胞表面CD分子檢測（以小鼠脾細(xì)胞CD3、CD4、CD8為例）：①小鼠脾臟用注射器芯輕輕研磨，過200目濾網(wǎng)，將細(xì)胞濾于含5%小牛血清的PBS中，吸取0.1ml（約1×106）置離心管中，加入CD3-PE-CY5、CD4-FITC及CD8-PE抗體（加入量參照供應(yīng)商的推薦量，一般抗體的加入量為1μg/1×106/0.1ml），室溫30min。⒉細(xì)胞表面CD分子檢測（以小鼠脾細(xì)胞CD3、CD4、CD8為38②加入細(xì)胞裂解液2ml室溫裂解RBC15min，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，吸棄上清，沉淀用0.5mlPBS懸浮，上機(jī)檢測；也可用2%多聚甲醛固定，4℃避光可保存至少24小時(shí)。用CD3設(shè)門法分析，流式報(bào)告中可給出CD3陽性細(xì)胞中CD4和CD8陽性細(xì)胞的百分比和熒光強(qiáng)度。通過流式報(bào)告計(jì)算出CD4與CD8的比值。注意兩點(diǎn)：①建議使用流式專用的RBC裂解液。②離心后上清一定要吸，不能倒，離心速度控制在3000rpm左右，1分鐘即可。②加入細(xì)胞裂解液2ml室溫裂解RBC15mi39⒊細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測定：用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子是當(dāng)前流式細(xì)胞術(shù)中一種較新的技術(shù)。在免疫反應(yīng)中，細(xì)胞因子擔(dān)當(dāng)了重要的角色。幾乎所有的細(xì)胞因子均可由各種不同類型的細(xì)胞在體外產(chǎn)生。但利用生物測定技術(shù)、酶標(biāo)法或PCR技術(shù)不能回答某一特定的細(xì)胞因子在體內(nèi)究竟是由哪種細(xì)胞產(chǎn)生的，即使將細(xì)胞分離制備出來，由于存在污染其它細(xì)胞的可能性，結(jié)果仍然缺乏可靠性。

⒊細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測定：40理想的測定技術(shù)應(yīng)使細(xì)胞因子的檢測能在可區(qū)分其表型的單細(xì)胞中進(jìn)行，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞術(shù)則可滿足這些要求。即流式細(xì)胞術(shù)可同時(shí)回答某種細(xì)胞因子是來源于哪種細(xì)胞表型陽性的細(xì)胞。樣品制備：①體外刺激誘導(dǎo)細(xì)胞使其產(chǎn)生細(xì)胞因子；②刺激同時(shí)加入Monensin（莫能菌素）以中斷胞內(nèi)細(xì)胞因子的運(yùn)輸，使新合成的細(xì)胞因子聚積在高爾基體。③固定細(xì)胞；④加入打孔劑使在細(xì)胞膜上造成許多小孔（打孔），從而使大分子的細(xì)胞因子抗體能透過膜；⑤熒光標(biāo)記。常用打孔劑有Saponin、Triton-X100。

理想的測定技術(shù)應(yīng)使細(xì)胞因子的檢測能在可區(qū)分41

4.胞內(nèi)蛋白的測定收集細(xì)胞（如果是含有紅細(xì)胞的有核細(xì)胞，則用裂解液去除紅細(xì)胞），用含5～10%的牛血清PBS懸浮，終濃度為70％的乙醇固定，固定后洗去酒精，沉淀細(xì)胞用0.2％Triton-x100破膜15min，加入一抗（一定要加飽和量）室溫30分鐘，離心洗滌兩次，洗去未結(jié)合的一抗，再加入二抗，室溫30min，洗滌二次，重懸于0.5mlPBS中上機(jī)測試。要設(shè)不加一抗但要加同型抗體的陰性對照。也可以不必固定。用這種方法可測周期蛋白、凋亡蛋白、基因表達(dá)產(chǎn)物等。4.胞內(nèi)蛋白的測定425.線粒體跨膜電位測定：Rh-123是線粒體的特異性染料，細(xì)胞被染料染色后，可測出細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱與線粒體跨膜電位的高低有關(guān)，可間接反映出細(xì)胞的功能。其方法如下：

5.線粒體跨膜電位測定：43取1×106細(xì)胞用PBS洗一次，再用1mlPBS懸浮，加入2.5mMRh-1232μl，使其終濃度為5μM，室溫作用30min，作用畢，用PBS洗細(xì)胞二次，0.5mlPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)測試。由于凋亡和死亡細(xì)胞線粒體受損，熒光較弱，而功能正常的細(xì)胞熒光較強(qiáng)。在流式報(bào)告中的直方圖中可出現(xiàn)兩個(gè)峰或一個(gè)峰。Rh-123的另一個(gè)用途是用于研究腫瘤細(xì)胞的耐藥。取1×106細(xì)胞用PBS洗一次，再用1mlP44

6.細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定以RPMI1640培養(yǎng)基配成濃度大約為1×106/ml的細(xì)胞懸液，每ml細(xì)胞懸液中加入終濃度為1－5μmol/mlFluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液（含10mmol/LHEPES，pH7.4)洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測。報(bào)告中可給出樣品的熒光強(qiáng)度。再根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。

45細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度計(jì)算公式：[Ca2+]=Kd(F－Fmin)/(Fmax－F)Kd為所用染料與Ca2+的解離常數(shù)：Kd

(Fluo-3):400nmol/L,Fmax為細(xì)胞內(nèi)Ca2+飽和時(shí)所測得的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)min為Fluo-3未與Ca2+結(jié)合時(shí)所測得的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為樣品的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度計(jì)算公式：467.網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測取肝素化靜脈血2.5μl，加入0.5mlRetic-COUNT試劑中，同時(shí)設(shè)PBS的陰性對照，室溫30分鐘后上流式細(xì)胞儀測試，報(bào)告中會給出網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度。樣品的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比為陽性管與陰性管的百分比之差。7.網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測478.活性氧物質(zhì)(ROS)的測定2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)是一種非熒光性小分子探針，可擴(kuò)散到細(xì)胞中并去酯化，通過氧化作用轉(zhuǎn)變成高熒光性的2,7-二氯熒光素（DCF)，因此可用于定量胞內(nèi)ROS。將細(xì)胞孵育于5μmol/L的DCFH-DA/PBS溶液中，37℃保溫15min，F(xiàn)CM檢測。DCF螢光的強(qiáng)弱則反映了細(xì)胞ROS的高低。8.活性氧物質(zhì)(ROS)的測定48七、常用熒光探針組合1.細(xì)胞表型分析雙色分析：FITC與PE三色分析：雙色分析+PE-CY5或PerCP-CY5.5。四色分析：三色分析+APC或CY5。2.胞內(nèi)蛋白與周期的關(guān)系分析蛋白標(biāo)記：FITC或GFP，DNA標(biāo)記：PI3.凋亡與壞死分析：凋亡用AnnexinV-FITC，壞死用PI，或細(xì)胞標(biāo)志物用FITC，凋亡用Annexin-PE，壞死用7-AAD。七、常用熒光探針組合1.細(xì)胞表型分析49八、如何看流式報(bào)告流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。幾個(gè)概念：%Gated：陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽性細(xì)胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測物質(zhì)的含量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一般用該值。GeoMean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽性細(xì)胞為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。八、如何看流式報(bào)告流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖50Dateacquired:12-Apr-05File:BMnormal1M.001DIPLOID:100.00%DipG0-G1:77.99%at47.06DipG2-M:3.81%at94.13DipS:18.20%G2/G1:2.00Dip%CV:4.61流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期Dateacquired:12-Apr-05流式細(xì)胞術(shù)分51Dateacquired:08-Mar-05File:NCDIPLOID:25.29%DipG0-G1:77.58%at38.10DipG2-M:5.43%at76.20DipS:16.99%G2/G1:2.00Dip%CV:3.99ANEUPLOID1:74.71%An1G0-G1:81.84%at45.11An1G2-M:3.70%at89.44An1S:14.45%G2/G1:1.98An1%CV:4.83An1DI:1.18TotalS-Phase:15.09%Dateacquired:08-Mar-0552Dateacquired:15-Mar-05Fi