磷脂酶1a輔助蛋白基因plaa1的基因克隆及酶學(xué)性質(zhì)分析

磷脂酶1a輔助蛋白基因plaa1的基因克隆及酶學(xué)性質(zhì)分析

磷脂酶a1（pholipas1，plaa1）廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、紡織業(yè)。它主要用于從植物中去除油脂。對PlaS進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PlaS屬于錨蛋白（Ankyrin,ANK）家族中的ANK2家族，根據(jù)GenBank(Protein-ID:AFN44705.1）數(shù)據(jù)分析，其蛋白結(jié)構(gòu)是由N端、ANK區(qū)域和C端三部分區(qū)域組成，其中ANK區(qū)域包含4個典型的ANK重復(fù)序列（ANKreapeat）。ANK是一種胞內(nèi)連接蛋白，為單鏈多肽，通常由若干個ANKrepeat串聯(lián)而成，每一個ANKrepeat包含30～33個氨基酸，組成β2α2的“L”型結(jié)構(gòu)基因剪接技術(shù)已經(jīng)成為分子截短的重要研究手段。為了揭示PlaS對PlaA1的調(diào)控機制，朱昊等為進一步探究PlaS對PlaA1酶活的關(guān)鍵作用區(qū)域，本研究從PlaA1和PlaS共表達基因plaB的C端處開始剪接，并對截短菌株進行了胞外酶學(xué)性質(zhì)研究，為后期闡明PlaS對PlaA1胞外酶活的調(diào)節(jié)機制提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1plab基因載體BP28工程菌，攜帶plaB基因（GenBankAccessionNo.JX138536.1），由本實驗室構(gòu)建；plaB基因來源于黏質(zhì)沙雷氏菌PL-06，其含有編碼PlaA1的基因plaA1與輔助蛋白基因plaS;BL21(DE3),JM109分別作為PlaA1及其截短基因的表達載體和克隆載體；選擇質(zhì)粒pET-28a（+）作為基因載體。磷酸氫二鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉、甘氨酸、氫氧化鈉國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。1.1.2培養(yǎng)基的制備LB培養(yǎng)基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，蒸餾水定容到1000mL，調(diào)pH值至7.0。PLB固體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基84.5mL,10%卵磷脂10mL,0.01%溴甲酚紫3mL,1mol/LCaCl乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，乳糖5g，磷酸氫二鈉0.025mol/L，磷酸二氫鈉0.025mol/L，硫酸鎂1mmol，甘氨酸7.5g，葡萄糖0.8g，蒸餾水定容至1000mL,115℃滅菌15min。1.2dycp-33d水平電泳槽EL20pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；冷凍高速離心機賽默飛世爾公司；DYCP-31D水平電泳槽北京六一儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；凝膠成像系統(tǒng)美國Syngene公司；基因?qū)雰x寧波新芝生物科技股份有限公司；PCR儀美國Bio-Rad公司；常壓室溫等離子體育種機北京思清源物科技有限公司。1.3方法1.3.1氨基酸序列的分析將GenBank上公布的黏質(zhì)沙雷氏菌PL-06PlaA1輔助蛋白PlaS的氨基酸序列（Protein-ID:AFN44705.1）在NCBI網(wǎng)站（/）進行在線分析。根據(jù)輔助蛋白的氨基酸序列的分析結(jié)果，設(shè)計輔助蛋白截短突變體。1.3.2質(zhì)粒dna的制備本研究利用實驗室先前構(gòu)建的一株產(chǎn)PlaA1工程菌BP28，在含δ50卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程菌BP28，于37℃搖床充分振蕩培養(yǎng)12～16h。按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒進行制備質(zhì)粒DNA樣品。以pET-28a(+)-plaB質(zhì)粒為模板，根據(jù)表1的引物，用Taq酶進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）擴增，擴增34個循環(huán)，條件如表2所示。對擴增后的片段進行膠回收，BamHI、HindIII雙酶切之后利用PCR純化試劑盒進行純化，純化后的樣品分別與pET-28a（+）載體連接，并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3）感受態(tài)細胞中。在PLB平板中挑取陽性菌株送入南京金絲瑞公司進行測序驗證。1.3.3培養(yǎng)乳液中無專酸4.5%誘導(dǎo)發(fā)酵分別從PLB平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子，接種到含有δ50卡那霉素的5mLLB試管中，37℃、200r/min搖床過夜培養(yǎng)，活化后按1%接種量接入含有δ50卡那霉素的100mL乳糖自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)8h。將發(fā)酵終點后的發(fā)酵液于12000r/min、4℃離心2min，上清液即為胞外粗酶液。由于各菌中的PlaA1蛋白表達量較低，表達水平無法計算，蛋白純化較為困難，因此后續(xù)采用胞外粗酶液進行酶學(xué)性質(zhì)的研究。1.3.4截短細菌酶活性測定1.3.4.1.酶活性測定參考文獻1.3.4.plb平板觀察將滅過菌的牙簽，分別蘸取各突變菌株于PLB平板上，將其放置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16h，待長出單菌落，再將其放置4℃培養(yǎng)箱進行低溫培養(yǎng)3～4d，可觀察到PLB平板上產(chǎn)生不同大小的透明圈，用游標卡尺測各菌落及其透明圈的直徑。1.3.5關(guān)于縮短菌株酶特性的研究1.3.5.溫度對各突變菌株的酶活力根據(jù)PlaA1酶活測定方法，保持其他酶促反應(yīng)條件不變，考察酶促反應(yīng)溫度對各突變菌株酶活力的影響，確定各突變菌株P(guān)laA1的最適溫度。以出發(fā)菌株BP28所產(chǎn)PlaA1在最適反應(yīng)溫度下的酶活力定義為100%，計算其他樣品的相對酶活力。將各截短菌株的PlaA1粗酶液置于最適溫度下進行水浴保溫處理，然后進行測定其殘余的酶活力。在保持其他條件相同的情況下，將未經(jīng)過保溫處理的酶活力定義為100%計算相對酶活力。1.3.5.酶活力的測定酶活測定方法同1.3.4節(jié)，保持其他酶促反應(yīng)條件不變，考察pH值對各突變菌株酶活力的影響，確定各突變菌株P(guān)laA1的最適pH值。以出發(fā)菌株BP28所產(chǎn)PlaA1在最適反應(yīng)pH值下的酶活力定義為100%，計算其他pH值的樣品相對酶活力。將各截短菌株P(guān)laA1粗酶液置于不同pH值下進行水浴保溫處理，然后迅速放置最適pH值下進行測定其殘余的酶活力。在保持其他條件相同的情況下，將未經(jīng)過酸堿處理的酶活力定義為100%計算相對酶活力。1.3.5.比酶活測定以卵磷脂為底物，按照4%、6%、8%、10%的底物濃度，在pH6、45℃條件下反應(yīng)15min，按照1.3.4節(jié)方法測定比酶活；反應(yīng)速率V為比酶活與反應(yīng)時間的比值，以反應(yīng)速率和底物濃度S的倒數(shù)為坐標，根據(jù)LineweaverBurk作圖法分別計算K1.4數(shù)據(jù)計算和圖紙設(shè)計采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Origin軟件進行圖表繪制。2結(jié)果與分析2.1plas氨基酸序列根據(jù)NCBI網(wǎng)站對PlaS進行BLAST在線比對的結(jié)果顯示，PlaS屬于ANK超家族，且含有4個典型的ANKrepeat，分別在PlaS氨基酸序列的46～76、78～109、111～142、145～176位置處。PlaS二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊以及無規(guī)卷曲組成，其中α-螺旋占比高達54.86%，無規(guī)卷曲占比達到34.24%。每一個ANKrepeat都包含著2個α-螺旋和2個β-折疊，內(nèi)部形成高度疏水區(qū)域。為探討PlaS對PlaA1酶活的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域，將其編碼基因進行截短，圖1為截短基因線性示意圖。2.2質(zhì)粒dna小量抽提以pET-28a-plaB質(zhì)粒為模板，利用PCR技術(shù)對截短基因片段進行大量擴增，并將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從瓊脂糖凝膠電泳條帶（圖2）表明，與截短目的基因相符。從PLB平板上分別挑取陽性克隆子，接種到含有δ50卡那霉素的5mLLB試管中，37℃、200r/min搖床過夜培養(yǎng)，按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒進行制備質(zhì)粒DNA樣品。將陽性菌株送去南京金絲瑞公司進行測序，通過軟件DNAMAN進行序列比對，序列一致。將其分別進行保存，用于后續(xù)實驗。2.3各截短菌株胞外比酶活的分析為研究plaS的截短基因?qū)laA1胞外酶活的影響，對各突變菌株所產(chǎn)透明圈進行圈徑比的計算。由于未截短菌株BP28與各截短突變菌株均含有plaA1基因，PlaA1可水解PLB平板上的大豆卵磷脂，在溴甲酚紫的作用下，可產(chǎn)生透明圈如圖3所示，圈徑比的大小表示各菌株胞外酶活的高低如表3所示。結(jié)合圖4各菌比酶活數(shù)據(jù)來看，當(dāng)PlaS的C端區(qū)域缺失，ANK結(jié)構(gòu)域保存3～4個ANKrepeat序列時，截短菌株AN-3與AN-4所產(chǎn)的PlaA1胞外比酶活分別為105.46U/mg和108.16U/mg，表現(xiàn)為胞外促進，達顯著水平（P<0.05），與未截短菌株BP28PlaA1胞外比酶活（60.88U/mg）相比分別高了73%和78%。當(dāng)ANKrepeat的個數(shù)繼續(xù)減少時，PlaA1胞外比酶活開始顯著降低，截短菌株AN-1、AN-2PlaA1胞外比酶活分別為59.31、60.74U/mg，當(dāng)PlaS的ANK結(jié)構(gòu)域完全缺失時，截短菌株ANPlaA1胞外比酶活為57.19U/mg，與截短菌株AN-1、AN-2PlaA1的胞外比酶活并無顯著差異。同時各菌株的胞內(nèi)比酶活表現(xiàn)出無顯著差異。從胞外比酶活的數(shù)據(jù)來看，在PlaS中ANK結(jié)構(gòu)域至少需要3個ANKreapeat串聯(lián)才會對PlaA1酶活表現(xiàn)為胞外促進作用。2.4各類型菌株的酶學(xué)性質(zhì)分析2.4.1突變菌plaa1酶活值的穩(wěn)定性在最適溫度45℃條件下，以未截短菌株BP28的PlaA1酶活定義為100%計算相對酶活力，截短菌株AN、AN-1、AN-2、AN-3、AN-4的PlaA1相對酶活力分別為85.29%、84.80%、87.25%、110.29%、122.06%（圖5a）。結(jié)合圖5b可知，在45℃條件下，雖然突變菌AN-3、AN-4所產(chǎn)PlaA1的相對酶活力表現(xiàn)最高，但是其熱穩(wěn)定性也表現(xiàn)最差，推測PlaS的C端部分可維持PlaA1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。當(dāng)PlaS的ANKrepeat被繼續(xù)截短時，AN、AN-1、AN-2所產(chǎn)PlaA1的相對酶活力有所下降，可能因為plaS的過度剪截在一定程度上破壞了輔助蛋白的結(jié)構(gòu)。2.4.2ph值的測定如圖6a所示，截短菌株AN-3、AN-4所產(chǎn)生的PlaA1的最適pH值與BP28的相同，最適pH值均為6。而截短菌株AN、AN-1、AN-2的最適pH值發(fā)生了酸性偏移，最適pH值為5，說明輔助蛋白對PlaA1的酸堿性進行了一定程度的調(diào)控。由圖6b可知，當(dāng)反應(yīng)體系的pH3～5時，各突變株的PlaA1活性呈現(xiàn)上升趨勢。各突變株在pH值在5～8的條件下均表現(xiàn)為較好的穩(wěn)定性。2.4.3常數(shù)及酶動力學(xué)雙倒數(shù)法確定各截短菌株P(guān)laA1的米氏常數(shù)及酶動力學(xué)見圖7、表4。根據(jù)所得到的各截短菌株的動力學(xué)參數(shù)（表5）來看，截短菌株AN-3與AN-4所產(chǎn)PlaA1的K3二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PlaS屬于ANK2家族。在TMHMM網(wǎng)站中預(yù)測PlaA1和PlaS的跨膜結(jié)構(gòu)圖中得到PlaA1是無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的，而PlaS在其N端區(qū)7～27aa有一個跨膜螺旋。PlaA1的胞外分泌可能是由于PlaS具有胞外運輸?shù)墓δ?。遺憾的是，PlaS與PlaA1獲得共表達時雖酶活較高，但是胞外蛋白表達量相對較低，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS）圖上幾乎看不到PlaS條帶。朱昊楊蒙,薛正蓮,甘玉飛,等.輔助蛋白基因的剪接對磷脂酶A1酶活的影響[J].食品科學(xué),2021,42(6):104-110.DOI:10.