PCR測定的技術(shù)要點(diǎn)

1PCR測定的技術(shù)要點(diǎn)

白雪麗

山東省立醫(yī)院檢驗(yàn)科2PCR測定的技術(shù)要點(diǎn)PCR的定義PCR的基本原理PCR反應(yīng)的基本成分及其對結(jié)果的影響PCR反應(yīng)的基本條件及其對結(jié)果的影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用及其優(yōu)缺點(diǎn)PCR假陽性與假陰性的預(yù)防對策3PCR簡史1983年Dr.Mullis發(fā)明PCR技術(shù)1985年Saiki將PCR技術(shù)應(yīng)用于鐮狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷1986年Erlich純化了耐熱的TaqDNA聚合酶1993年Dr.Mullis獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)4PCR的定義PCR（polymerasechainreaction)即聚合酶鏈反應(yīng)，是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在體外特異性擴(kuò)增DNA或RNA片段的技術(shù)。它能把極微量的遺傳物質(zhì)迅速而簡便的擴(kuò)增百萬倍，使原來無法分析和檢測的各種項(xiàng)目得以完成，它的問世，為傳統(tǒng)基因分析和診斷技術(shù)帶來了變革。5PCR的基本原理6PCR的基本原理利用

DNA分子能夠變性與復(fù)性的特性，以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，由一對引物介導(dǎo)，以4種dNTP為底物，經(jīng)DNA多聚酶催化，在體外快速擴(kuò)增特異性DNA序列

。

7PCR原理示意圖90~95℃變性40~60℃退火70~75℃延伸第一循環(huán)第二循環(huán)模板變性、退火延伸第三循環(huán)變性、退火、延伸總擴(kuò)增產(chǎn)物：2n倍增加長片段序列：2n倍增加目的DNA：2n-2n倍增加目的DNA5'3'3'5'5'3'5'3'8PCR反應(yīng)的基本成分

及其對結(jié)果的影響9PCR反應(yīng)的基本成分及其對結(jié)果的影響

緩沖液引物脫氧核糖核苷三磷酸（dATPdTTPdGTPdCTP)模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+PCR反應(yīng)體系：

30~100μl10緩沖液10mmol/lTris.Cl提供適合反應(yīng)的PH值（PH8.4）50mmol/lKCl促進(jìn)引物退火10μg/ml明膠或血清白蛋白為Taq酶的保護(hù)劑11引物引物大小上下游引物均為人工合成20nt左右的寡核苷酸單鏈引物濃度一般在0.1~1μmol/l濃度過高，非特異性增加濃度過低，敏感性下降引物特異性引物特異性決定擴(kuò)增的特異性，不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性12脫氧核糖核苷三磷酸（dATPdTTPdGTPdCTP)為DNA合成的基本原料，要求四種dNTP等濃度混合（50~200μmol/l）13模板種類DNA或RNA濃度>102copies/ml純度標(biāo)本需要純化14TaqDNA聚合酶一般30~100μl反應(yīng)體系中需加入1~2U濃度過高，非特異性增加濃度過低，產(chǎn)物量降低15Mg2+一般為1.5mmol/l,為Taq酶活性所必需的濃度過高，非特異性增加濃度過低，產(chǎn)物量降低16PCR反應(yīng)條件及對結(jié)果的影響17PCR反應(yīng)條件及對結(jié)果的影響變性溫度與時(shí)間復(fù)性溫度與時(shí)間延伸溫度與時(shí)間循環(huán)數(shù)18變性溫度與時(shí)間PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有模板DNA或PCR產(chǎn)物的雙鏈完全解開，才能有效地和引物結(jié)合，而這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。變性溫度越高、時(shí)間越長，變性就越充分。但溫度過高、時(shí)間過長又會(huì)影響Taq酶活性。常選用的循環(huán)變性溫度為94℃時(shí)間30S。在PCR反應(yīng)開始階段，反應(yīng)體系中主要為原始模板，鏈較長，一般在進(jìn)行PCR循環(huán)之前，先94℃預(yù)變性10min。19復(fù)性溫度與時(shí)間復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好，但容易出現(xiàn)錯(cuò)配，增加非特異性結(jié)合。溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右，時(shí)間30S。20延伸溫度與時(shí)間引物延伸溫度一般為72℃。因?yàn)樵谶@個(gè)溫度下Taq酶有較高的活性，并且引物和模板的結(jié)合較為穩(wěn)定。一般72℃延伸1min對于

1kb以內(nèi)的擴(kuò)增片段就已足夠，如果擴(kuò)增片段>1kb，延伸時(shí)間可相應(yīng)延長。21循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。22PCRPCR擴(kuò)增曲線23PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)24PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)凝膠電泳分析技術(shù)探針雜交技術(shù)25凝膠電泳分析技術(shù)主要包括瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中瓊脂糖凝膠電泳因操作簡單，較常用，一般采用濃度為1～2%的瓊脂糖凝膠。通過電泳分析技術(shù)可直接觀察到有無擴(kuò)增產(chǎn)物，及產(chǎn)物片段的大小?？捎糜跀U(kuò)增產(chǎn)物的定性分析。26HCMVPCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果

594bp600bp2652bp800bp50bp350bpM12327探針雜交技術(shù)探針（probe)是通過一定手段標(biāo)記的已知核酸序列。探針雜交技術(shù)的原理：在一定條件下擴(kuò)增產(chǎn)物與其特異性同源探針可按堿基互補(bǔ)原則形成雜交鏈，通過對其中探針信號的檢測來獲得產(chǎn)物的信息。28探針雜交技術(shù)膜上雜交技術(shù)微孔板雜交技術(shù)熒光探針標(biāo)記技術(shù)29膜上雜交技術(shù)通常采用尼龍膜或硝酸纖維素膜?；静僮魇菍⒋郎y核酸片段通過凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)印到膜上或直接點(diǎn)樣于膜上再與探針進(jìn)行雜交，然后經(jīng)過漂洗、顯色得到檢測結(jié)果。（Southern印跡、Northern印跡、斑點(diǎn)雜交）可對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，但對操作要求較高，一般只適用于科研工作。30膜上雜交技術(shù)檢測結(jié)果31微孔板雜交技術(shù)類似于ELISA技術(shù)中的雙抗體夾心法。首先通過微孔板孔壁上包被的捕獲探針來捕獲PCR產(chǎn)物。然后再用帶有標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物另一區(qū)域雜交，經(jīng)過漂洗顯色即可判斷結(jié)果。可用酶標(biāo)儀判讀，用于半定量測定。但整個(gè)操作過程不是全封閉的，易造成擴(kuò)增產(chǎn)物污染。32微孔板雜交技術(shù)原理示意圖雜交雜交洗板顯色雜交洗板顯色33熒光探針雜交技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，我們通常所說的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)多采用的該項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)反應(yīng)體系中除常規(guī)引物外，還引入了熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針，探針可與模板一對一結(jié)合。包括：Taqman技術(shù)Lightcycler技術(shù)Molecularbeacon技術(shù)34Taqman技術(shù)原理reporterquencher35熒光探針雜交技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：在全封閉條件下進(jìn)行PCR定量，有效防止了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。實(shí)時(shí)監(jiān)測，熒光定量，結(jié)果直觀，定量準(zhǔn)確。結(jié)合了PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，特異性強(qiáng)，靈敏度高。36PCR技術(shù)的應(yīng)用37PCR的應(yīng)用科研：基因重組、蛋白表達(dá)DNA測序基因突變和重組的研究分子進(jìn)化和種系發(fā)育的研究臨床：感染性疾病的病原體檢測遺傳性疾病的診斷器官移植中的基因配型癌基因的檢測38PCR在病原體檢測中的優(yōu)缺點(diǎn)39優(yōu)點(diǎn):靈敏度高102copies/ml即可，斑點(diǎn)雜交敏感性為105copies/ml特異性強(qiáng)主要由引物特異性決定，對于一個(gè)20nt的引物其非特異性配對的概率為1/420。PCR可以克服血清學(xué)診斷中存在的交叉反應(yīng)可早診斷可在免疫學(xué)診斷窗口期就早期診斷不受患者免疫狀態(tài)的影響PCR可對病原體進(jìn)行定量分析并可對病原體進(jìn)行基因分型，指導(dǎo)臨床用藥和治療。40不足之處：操作復(fù)雜，技術(shù)不易被熟練掌握價(jià)格昂貴存在假陽性和假陰性結(jié)果41PCR假陽性和假陰性產(chǎn)生的

原因和預(yù)防對策42假陽性產(chǎn)生的原因假陽性多為污染所致，包括：產(chǎn)物的污染樣品的交叉污染重組質(zhì)?；蚺囵B(yǎng)物及其它的污染43假陽性的防范措施PCR實(shí)驗(yàn)室要有嚴(yán)格的分區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物檢測區(qū)）要建立規(guī)范化的操作程序，并嚴(yán)格按程序操作。吸取標(biāo)本時(shí)使用帶濾塞的吸頭試驗(yàn)前后用紫外線燈照射工作臺(tái)面和室內(nèi)設(shè)施注意實(shí)驗(yàn)室的定期通風(fēng)使用防“污染”的PCR試劑(含UNG）44尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：

可防止以前擴(kuò)增產(chǎn)物對下一次PCR反映的影響。是一個(gè)連續(xù)的防污染過程。每次實(shí)驗(yàn)都必須使用。一般對103~104拷貝/ml的產(chǎn)物污染有效。在反應(yīng)體系中用dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中含大量dU，在下一次PCR反應(yīng)中反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)NG可去除dU，加熱后產(chǎn)物鏈斷裂，不能作為PCR反應(yīng)的模板，而UNG在PCR循環(huán)高溫變性一步就會(huì)失活，所以，對含dU的新合成PCR產(chǎn)物沒有影響。45

TATATATATA

PCRAUAUAU

UNGAAA

加熱AAA

×

PCR46出現(xiàn)污染后的對策積極尋找污染源徹底清潔工作環(huán)境、器械和儀器紫外照射工作臺(tái)面及工作區(qū)徹底通風(fēng)47假陰性產(chǎn)生的原因操作不當(dāng)試劑質(zhì)量差或過期儀器設(shè)備不準(zhǔn)確其他48標(biāo)本的采集和處理49標(biāo)本的采集標(biāo)本采集的時(shí)間標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備標(biāo)本的類型和采集量采集標(biāo)本的質(zhì)量采集及運(yùn)輸容器標(biāo)本采集中的防污染50標(biāo)本采集的時(shí)間在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。51標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備采集部位的清潔消毒可去除微生物和其它雜物，但應(yīng)適度，過度消毒可能會(huì)破壞靶微生物。52標(biāo)本的類型和采集量標(biāo)本采集類型要根據(jù)所檢測的病原體而定，不同病原體存在部位不同，采集標(biāo)本種類