PCR測定的技術要點

1PCR測定的技術要點

白雪麗

山東省立醫(yī)院檢驗科2PCR測定的技術要點PCR的定義PCR的基本原理PCR反應的基本成分及其對結果的影響PCR反應的基本條件及其對結果的影響PCR擴增產(chǎn)物的分析技術PCR技術的應用及其優(yōu)缺點PCR假陽性與假陰性的預防對策3PCR簡史1983年Dr.Mullis發(fā)明PCR技術1985年Saiki將PCR技術應用于鐮狀紅細胞貧血的產(chǎn)前診斷1986年Erlich純化了耐熱的TaqDNA聚合酶1993年Dr.Mullis獲得諾貝爾化學獎4PCR的定義PCR（polymerasechainreaction)即聚合酶鏈反應，是一種模擬天然DNA復制過程，在體外特異性擴增DNA或RNA片段的技術。它能把極微量的遺傳物質(zhì)迅速而簡便的擴增百萬倍，使原來無法分析和檢測的各種項目得以完成，它的問世，為傳統(tǒng)基因分析和診斷技術帶來了變革。5PCR的基本原理6PCR的基本原理利用

DNA分子能夠變性與復性的特性，以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對引物介導，以4種dNTP為底物，經(jīng)DNA多聚酶催化，在體外快速擴增特異性DNA序列

。

7PCR原理示意圖90~95℃變性40~60℃退火70~75℃延伸第一循環(huán)第二循環(huán)模板變性、退火延伸第三循環(huán)變性、退火、延伸總擴增產(chǎn)物：2n倍增加長片段序列：2n倍增加目的DNA：2n-2n倍增加目的DNA5'3'3'5'5'3'5'3'8PCR反應的基本成分

及其對結果的影響9PCR反應的基本成分及其對結果的影響

緩沖液引物脫氧核糖核苷三磷酸（dATPdTTPdGTPdCTP)模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+PCR反應體系：

30~100μl10緩沖液10mmol/lTris.Cl提供適合反應的PH值（PH8.4）50mmol/lKCl促進引物退火10μg/ml明膠或血清白蛋白為Taq酶的保護劑11引物引物大小上下游引物均為人工合成20nt左右的寡核苷酸單鏈引物濃度一般在0.1~1μmol/l濃度過高，非特異性增加濃度過低，敏感性下降引物特異性引物特異性決定擴增的特異性，不應與非擴增區(qū)域有同源性12脫氧核糖核苷三磷酸（dATPdTTPdGTPdCTP)為DNA合成的基本原料，要求四種dNTP等濃度混合（50~200μmol/l）13模板種類DNA或RNA濃度>102copies/ml純度標本需要純化14TaqDNA聚合酶一般30~100μl反應體系中需加入1~2U濃度過高，非特異性增加濃度過低，產(chǎn)物量降低15Mg2+一般為1.5mmol/l,為Taq酶活性所必需的濃度過高，非特異性增加濃度過低，產(chǎn)物量降低16PCR反應條件及對結果的影響17PCR反應條件及對結果的影響變性溫度與時間復性溫度與時間延伸溫度與時間循環(huán)數(shù)18變性溫度與時間PCR反應中模板DNA的變性十分重要。只有模板DNA或PCR產(chǎn)物的雙鏈完全解開，才能有效地和引物結合，而這種結合是PCR擴增的基礎。變性溫度越高、時間越長，變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq酶活性。常選用的循環(huán)變性溫度為94℃時間30S。在PCR反應開始階段，反應體系中主要為原始模板，鏈較長，一般在進行PCR循環(huán)之前，先94℃預變性10min。19復性溫度與時間復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好，但容易出現(xiàn)錯配，增加非特異性結合。溫度太高不利于復性，大多數(shù)PCR反應的復性溫度在55℃左右，時間30S。20延伸溫度與時間引物延伸溫度一般為72℃。因為在這個溫度下Taq酶有較高的活性，并且引物和模板的結合較為穩(wěn)定。一般72℃延伸1min對于

1kb以內(nèi)的擴增片段就已足夠，如果擴增片段>1kb，延伸時間可相應延長。21循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。22PCRPCR擴增曲線23PCR擴增產(chǎn)物的分析技術24PCR擴增產(chǎn)物的分析技術凝膠電泳分析技術探針雜交技術25凝膠電泳分析技術主要包括瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中瓊脂糖凝膠電泳因操作簡單，較常用，一般采用濃度為1～2%的瓊脂糖凝膠。通過電泳分析技術可直接觀察到有無擴增產(chǎn)物，及產(chǎn)物片段的大小?？捎糜跀U增產(chǎn)物的定性分析。26HCMVPCR產(chǎn)物電泳分析結果

594bp600bp2652bp800bp50bp350bpM12327探針雜交技術探針（probe)是通過一定手段標記的已知核酸序列。探針雜交技術的原理：在一定條件下擴增產(chǎn)物與其特異性同源探針可按堿基互補原則形成雜交鏈，通過對其中探針信號的檢測來獲得產(chǎn)物的信息。28探針雜交技術膜上雜交技術微孔板雜交技術熒光探針標記技術29膜上雜交技術通常采用尼龍膜或硝酸纖維素膜?；静僮魇菍⒋郎y核酸片段通過凝膠電泳分離后轉印到膜上或直接點樣于膜上再與探針進行雜交，然后經(jīng)過漂洗、顯色得到檢測結果。（Southern印跡、Northern印跡、斑點雜交）可對產(chǎn)物進行定性分析，但對操作要求較高，一般只適用于科研工作。30膜上雜交技術檢測結果31微孔板雜交技術類似于ELISA技術中的雙抗體夾心法。首先通過微孔板孔壁上包被的捕獲探針來捕獲PCR產(chǎn)物。然后再用帶有標記的檢測探針與產(chǎn)物另一區(qū)域雜交，經(jīng)過漂洗顯色即可判斷結果。可用酶標儀判讀，用于半定量測定。但整個操作過程不是全封閉的，易造成擴增產(chǎn)物污染。32微孔板雜交技術原理示意圖雜交雜交洗板顯色雜交洗板顯色33熒光探針雜交技術是近幾年發(fā)展起來的一項新技術，我們通常所說的實時熒光定量PCR技術多采用的該項技術，該技術反應體系中除常規(guī)引物外，還引入了熒光基團標記的特異性探針，探針可與模板一對一結合。包括：Taqman技術Lightcycler技術Molecularbeacon技術34Taqman技術原理reporterquencher35熒光探針雜交技術優(yōu)點：在全封閉條件下進行PCR定量，有效防止了擴增產(chǎn)物的污染。實時監(jiān)測，熒光定量，結果直觀，定量準確。結合了PCR技術與探針雜交技術的優(yōu)點，特異性強，靈敏度高。36PCR技術的應用37PCR的應用科研：基因重組、蛋白表達DNA測序基因突變和重組的研究分子進化和種系發(fā)育的研究臨床：感染性疾病的病原體檢測遺傳性疾病的診斷器官移植中的基因配型癌基因的檢測38PCR在病原體檢測中的優(yōu)缺點39優(yōu)點:靈敏度高102copies/ml即可，斑點雜交敏感性為105copies/ml特異性強主要由引物特異性決定，對于一個20nt的引物其非特異性配對的概率為1/420。PCR可以克服血清學診斷中存在的交叉反應可早診斷可在免疫學診斷窗口期就早期診斷不受患者免疫狀態(tài)的影響PCR可對病原體進行定量分析并可對病原體進行基因分型，指導臨床用藥和治療。40不足之處：操作復雜，技術不易被熟練掌握價格昂貴存在假陽性和假陰性結果41PCR假陽性和假陰性產(chǎn)生的

原因和預防對策42假陽性產(chǎn)生的原因假陽性多為污染所致，包括：產(chǎn)物的污染樣品的交叉污染重組質(zhì)粒或培養(yǎng)物及其它的污染43假陽性的防范措施PCR實驗室要有嚴格的分區(qū)（試劑準備區(qū)、標本準備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物檢測區(qū)）要建立規(guī)范化的操作程序，并嚴格按程序操作。吸取標本時使用帶濾塞的吸頭試驗前后用紫外線燈照射工作臺面和室內(nèi)設施注意實驗室的定期通風使用防“污染”的PCR試劑(含UNG）44尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：

可防止以前擴增產(chǎn)物對下一次PCR反映的影響。是一個連續(xù)的防污染過程。每次實驗都必須使用。一般對103~104拷貝/ml的產(chǎn)物污染有效。在反應體系中用dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中含大量dU，在下一次PCR反應中反應體系中加入UNG可去除dU，加熱后產(chǎn)物鏈斷裂，不能作為PCR反應的模板，而UNG在PCR循環(huán)高溫變性一步就會失活，所以，對含dU的新合成PCR產(chǎn)物沒有影響。45

TATATATATA

PCRAUAUAU

UNGAAA

加熱AAA

×

PCR46出現(xiàn)污染后的對策積極尋找污染源徹底清潔工作環(huán)境、器械和儀器紫外照射工作臺面及工作區(qū)徹底通風47假陰性產(chǎn)生的原因操作不當試劑質(zhì)量差或過期儀器設備不準確其他48標本的采集和處理49標本的采集標本采集的時間標本采集部位的準備標本的類型和采集量采集標本的質(zhì)量采集及運輸容器標本采集中的防污染50標本采集的時間在疾病發(fā)展過程中，標本采集過早或過晚都會出現(xiàn)假陰性結果。51標本采集部位的準備采集部位的清潔消毒可去除微生物和其它雜物，但應適度，過度消毒可能會破壞靶微生物。52標本的類型和采集量標本采集類型要根據(jù)所檢測的病原體而定，不同病原體存在部位不同，采集標本種類