市場(chǎng)常見DNA測(cè)序儀課件

DNA測(cè)序儀市場(chǎng)常見測(cè)序儀器介紹DNA測(cè)序儀市場(chǎng)常見測(cè)序儀器介紹1測(cè)序技術(shù)概況測(cè)序儀器的原理和特性常見測(cè)序儀器的比較如何選擇合適的測(cè)序儀測(cè)序技術(shù)概況測(cè)序儀器的原理和特性常見測(cè)序儀器的比較如何選擇合2Sanger雙脫氧鏈終止法MaxamGilbertDNA化學(xué)降解法循環(huán)芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高通量、高效率、高準(zhǔn)確度的測(cè)序大大降低了測(cè)序的成本單分子測(cè)序試劑用量少，成本更低第一代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)Sanger雙脫氧鏈終止法循環(huán)芯片技術(shù)單分子測(cè)序第一代第二代3代表儀器測(cè)序原理ABI3730XLsanger法：毛細(xì)管電泳分離電腦熒光檢測(cè)數(shù)據(jù)分析可得到DNA堿基序列第一代代表儀器測(cè)序原理ABI3730XLsanger法：毛細(xì)管4第一代—ABI3730XL毛細(xì)管規(guī)格:96道毛細(xì)管毛細(xì)管長(zhǎng)度:50cm凝膠的規(guī)格:POP-7液體分離膠配套的試劑:基因測(cè)序(BigDye3.1v和5×Sequencebuffer)

基因分型(Liz120,Liz500,ROX500)基因測(cè)序及分型的運(yùn)行時(shí)間時(shí)間：96樣本~2h

通量：（94-96）/384*12讀長(zhǎng)：700-900bp優(yōu)勢(shì)：方法可靠、準(zhǔn)確度高,且已形成規(guī)模化,特別是在PCR產(chǎn)物測(cè)序、質(zhì)粒和細(xì)菌人工染色體的末端測(cè)序、以及STR基因分型方面,發(fā)揮著重要作用.性能：不足：通量低；成本相對(duì)較高第一代—ABI3730XL毛細(xì)管規(guī)格:96道毛細(xì)管優(yōu)勢(shì)5測(cè)序原理：文庫(kù)制備乳液PCR擴(kuò)增焦磷酸測(cè)序第二代ROCH-454IlluminaGA

ABISOLID測(cè)序原理：制備DNA文庫(kù)乳液PCR/微珠富集連接酶測(cè)序SOLID的雙堿基編碼矩陣測(cè)序原理：制備DNA文庫(kù)橋式PCR產(chǎn)生DNA簇測(cè)序

測(cè)序原理：第二代ROCH-454IlluminaGAAB6第二代—ABISOLID優(yōu)勢(shì)：系統(tǒng)可擴(kuò)展性最大的靈活性全基因表達(dá)圖譜分析更多RNA研究SNP分析甲基化分析第二代—ABISOLID優(yōu)勢(shì)：7第二代—IlluminaGA技術(shù)特點(diǎn)：測(cè)序通量高：每個(gè)測(cè)序反應(yīng)能達(dá)到3G以上的數(shù)據(jù)通量；

準(zhǔn)確率高：≥

98.5%，同時(shí)也有效地解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題；

低成本：比傳統(tǒng)毛細(xì)管測(cè)序技術(shù)成本的1%還低；

DNA序列的讀取長(zhǎng)度不斷增加，當(dāng)前達(dá)到200bp；

可以進(jìn)行Pair-End雙向測(cè)序，目前Pair-End文庫(kù)插入片段大小范圍可由200bp到10kb；

每張芯片有8個(gè)通道，每個(gè)通道可單獨(dú)測(cè)序一個(gè)樣品，也可以把多個(gè)樣品混合在一起測(cè)序。優(yōu)勢(shì)：可擴(kuò)展的超高通量需要樣品量少（低至100ng)簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化單個(gè)或配對(duì)末端支持第二代—IlluminaGA技術(shù)特點(diǎn)：優(yōu)勢(shì)：8第二代—ROCH-454技術(shù)特點(diǎn)：在7.5小時(shí)的一個(gè)設(shè)備運(yùn)行時(shí)間內(nèi)，可以讀取超過1億個(gè)的堿基信息?更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，平均可達(dá)200-300個(gè)堿基?更高的通量，每次運(yùn)行可獲取超過40萬個(gè)讀長(zhǎng)?超過200個(gè)堿基的單個(gè)讀長(zhǎng)準(zhǔn)確性大于99.5％?一致準(zhǔn)確性大于99.99％?無需克隆和挑取克隆子的操作過程?生成完整的基因組庫(kù)，避免了克隆偏差的影響優(yōu)勢(shì)：454平臺(tái)的最突出優(yōu)勢(shì)是讀長(zhǎng)，目前454系統(tǒng)的序列讀長(zhǎng)已超過400bp，但成本也相對(duì)較高第二代—ROCH-454技術(shù)特點(diǎn)：優(yōu)勢(shì)：9最后借助聚合酶將熒光標(biāo)記的單核苷酸摻入到引物上。采集熒光信號(hào)，切除熒光標(biāo)記基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測(cè)序反應(yīng)，如此反復(fù)，最終獲得完整的序列信息代表儀器測(cè)序原理HeliScope單分子邊合成邊測(cè)序?qū)⒒蚪MDNA切割成隨機(jī)的小片段DNA分子，并且在每個(gè)片段末端加上poly-A尾通過poly-A尾和固定在芯片上的poly-T雜交，將待測(cè)模板固定到芯片上，制成測(cè)序芯片第三代最后借助聚合酶將熒光標(biāo)記的單核苷酸摻入到引物上。采集熒光信號(hào)10第三代—HeliScope技術(shù)特點(diǎn)：它的測(cè)序是不同步的，即每條模板測(cè)序的程度不同，依據(jù)模板本身的序列而定，但由于使用的是單分子測(cè)序，故不會(huì)存在相移問題。在熒光標(biāo)記的核苷酸上沒有終止基因?？梢酝ㄟ^“兩步法”，即測(cè)序兩次來提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。由于大量的來標(biāo)記堿基、不發(fā)光堿基或污染堿基摻入，所以使用HeliScope測(cè)序儀檢測(cè)缺失突變的出錯(cuò)率最高，單次檢測(cè)誤差率為2%-7%，兩次檢測(cè)誤差率為0.2%-1%。不過檢測(cè)堿基替換突變的準(zhǔn)確率是目前測(cè)序儀中最高的。優(yōu)勢(shì)：?jiǎn)畏肿訙y(cè)序減少了試劑的使用，測(cè)序成本價(jià)格大大降低不需要擴(kuò)增建立DNA庫(kù)，從而切斷數(shù)據(jù)結(jié)果中潛在錯(cuò)誤的來源第三代—HeliScope技術(shù)特點(diǎn)：優(yōu)勢(shì)：11常見測(cè)序儀的比較由上表可以看出，第二代和第三代測(cè)序儀由于消耗的試劑少在測(cè)序費(fèi)用上有了明顯的降低，但是在讀長(zhǎng)上第一代的3730xl依然具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，不過隨著技術(shù)的完善，新一代的測(cè)序儀依然擁有極大的提升空間。常見測(cè)序儀的比較由上表可以看出，第二代和第三代測(cè)序儀由于消耗12本片五種測(cè)序儀的比較本片五種測(cè)序儀的比較13測(cè)序的準(zhǔn)確度和各自的優(yōu)勢(shì)的考慮：項(xiàng)目考量：如何選擇合適的測(cè)序儀比如是善于發(fā)現(xiàn)插入、缺失突變還是善于發(fā)現(xiàn)堿基替換突變。比如重測(cè)序?qū)τ跍y(cè)序長(zhǎng)度的要求沒有從頭測(cè)序的要求高；對(duì)于需要依靠標(biāo)簽計(jì)數(shù)的測(cè)序項(xiàng)目，會(huì)更加需要能將待測(cè)片段分割成盡量多、盡量小片段的測(cè)序方法。費(fèi)用考量：3730xl適用于對(duì)kb~mb長(zhǎng)度的DNA片段進(jìn)行的小規(guī)模的測(cè)序項(xiàng)目。大規(guī)模測(cè)序項(xiàng)目中大家還是傾向于選擇新一代測(cè)序儀，主要差距在于費(fèi)用，新型測(cè)序儀能將測(cè)序費(fèi)用降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。測(cè)序的準(zhǔn)確度和各自的優(yōu)勢(shì)的考慮：項(xiàng)目考量：如何選擇合適的測(cè)序14附錄三代測(cè)序技術(shù)的總結(jié)第一代測(cè)序技術(shù)憑借其長(zhǎng)的序列片段和高的準(zhǔn)確率，適合對(duì)新物種進(jìn)行基因組長(zhǎng)距框架的搭建以及后期GAP填補(bǔ)，但是成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品的測(cè)序工作。第二代測(cè)序技術(shù)中：454序列片段最長(zhǎng)，比較適合對(duì)未知基因組從頭測(cè)序，搭建主體結(jié)構(gòu)，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時(shí)準(zhǔn)確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價(jià)位低的特點(diǎn)，可以用于大基因組和小基因組的測(cè)序和重測(cè)序。SOLiD基于雙堿基編碼系統(tǒng)