滬科教版選修1生物技術(shù)實(shí)踐《蛋白質(zhì)的提取和分離》教學(xué)設(shè)計(jì)

滬科教版選修1生物技術(shù)實(shí)踐《蛋白質(zhì)的提取和分離》教學(xué)設(shè)計(jì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)旨在讓學(xué)生了解蛋白質(zhì)的提取和分離的基本原理和方法，掌握不同蛋白質(zhì)提取方法和分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能和科學(xué)思維能力，加強(qiáng)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)協(xié)作、溝通交流和創(chuàng)新能力，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和綜合實(shí)踐項(xiàng)目打下基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟2.1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)主要包括以下幾個(gè)部分：蛋白質(zhì)的提取方法：不同樣本的提取方法選擇，包括動(dòng)物組織、微生物和植物的提取方法；蛋白質(zhì)的定量方法：BCA法和Lowry法；蛋白質(zhì)的分離方法：離心分離、SDS凝膠電泳和IEF等方法的比較。2.2實(shí)驗(yàn)步驟第一部分：蛋白質(zhì)的提取方法1.1動(dòng)物組織樣本的提取方法步驟一：取材1）將大鼠肝組織切碎，放入50mL離心管中；2）在2-8℃條件下保持冰冷。步驟二：草酸提取1）將50mM草酸緩沖液pH6.5，含有10%甘油、0.1mmol/LEDTA和適量N，S，SB侵蝕液制備好；2）向15mg組織樣本中加入1mL上述提取液，共pipette10min；3）待樣本溶液離心10min,12000r/min，將上清提取液轉(zhuǎn)移到2mL離心管中即可。1.2微生物樣本的提取方法步驟一：細(xì)菌和真菌菌落的生長(zhǎng)培養(yǎng)步驟二：菌體提取1）將生長(zhǎng)培養(yǎng)菌落(1g)裝入離心管中，加入4mL0°CPBS(pH=7.4)，振動(dòng)3次，振動(dòng)10s，最后離心10min，3000r/min，將上清移至2mL離心管中；2）利用5mL細(xì)胞破碎手持振蕩器，頻率180-200Hz振蕩45次，然后4℃接連離心2次，從上清中提取細(xì)菌蛋白質(zhì)即可。1.3植物樣本的提取方法步驟一：植物樣本的處理1）測(cè)定植物樣本的鮮重、干重；2）將干重草本植物研磨成粉末狀，過(guò)篩（40目）后儲(chǔ)存于4℃。步驟二：植物蛋白質(zhì)的提取1）向所需提取工作量的試管中添加植物粉末；2）添加萃取緩沖液來(lái)選擇萃取方法（如PBS、Tris-HCl、不同pH的緩沖液）；3）使用超聲波法提取植物蛋白質(zhì)；4）將提取的液體離心，沉淀上清液中的植物蛋白質(zhì)即可。第二部分：蛋白質(zhì)的定量方法2.1BCA法步驟一：制備標(biāo)準(zhǔn)曲線1）取適量BSA，濃度1mg/ml分別加入合適比例的0.1MNaOH和0.1NNa2CO3中制備成10-50μg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)藥液；2）按一定比例稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)，給出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；步驟二：定量測(cè)定樣品1）按指定比例混合藥液、標(biāo)準(zhǔn)藥液和待測(cè)液；2）在微板中裝樣，分別加入200μl糖醛酸試劑和40μlCuSO4試劑，在37℃反應(yīng)30min后，讀取460nm吸光度；3）將吸光度數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相乘，即可計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。2.2Lowry法步驟一：制備標(biāo)準(zhǔn)曲線1）取適量BSA，濃度1mg/ml分別加入0.5%CuSO4冰醋酸和Folin-Ciocalteau試劑液中制備成10-50μg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)藥液；2）按一定比例稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)，給出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；步驟二：定量測(cè)定樣品1）按指定比例混合藥液、標(biāo)準(zhǔn)藥液和待測(cè)液；2）在容量燒杯中加入藥液工作液，視情況需加入轉(zhuǎn)化液，加入10μL待測(cè)物質(zhì)，放入水浴或加熱板中恒溫反應(yīng)30min，酸化反應(yīng)1min，最后加入1.75mL含2%Na2CO3的反應(yīng)中和液反應(yīng)2min，將吸光度值讀取在660nm；3）將吸光度數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相乘，即可計(jì)算出待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。第三部分：蛋白質(zhì)的分離方法3.1離心分離步驟一：制備離心液1）制備10mM的HEPES緩沖液和150mMNaCl；2）加入1mMEDTA和1mMPMSF；步驟二：釋放裂解物1）將培養(yǎng)基含細(xì)胞的離心管放入直立式離心機(jī)中，以16000rpm離心30min，收集液面上清液，加入適量標(biāo)準(zhǔn)面積的離心液中；2）重復(fù)離心10次，收集液面上清液即可。3.2SDS凝膠電泳步驟一：制備凝膠1）制備3%凝膠：112.5mL溶液、7.5mL亞鐵氰酸鉀和7.5mL過(guò)硫酸銨；2）制備7.5%凝膠板，加入7.5mL亞鐵氰酸鉀和7.5mL過(guò)硫酸銨；3）分別向兩個(gè)小孔中注入上述兩個(gè)緩沖液，待定膠板冷卻、凝膠和梳子制備完畢后，加入上述緩沖液制備上、下緩沖池和樣品孔。步驟二：電泳實(shí)驗(yàn)1）向凝膠板的孔中均勻滴加蛋白樣品，凝膠電泳，載入蛋白樣品，電泳開始，培養(yǎng)架在220V下運(yùn)行；2）取出凝膠板，清洗掉高濃度熒光素，放到熒光掃描分析系統(tǒng)中掃描讀取數(shù)據(jù)。3.3IEF步驟一：制備膠液1）準(zhǔn)備polyacrylamide膠；2）制備膠液工作液中含有4%甲醛，4%Triton-X100，0.5%懸浮粉，0.03%茚三酸；步驟二：制備蛋白質(zhì)樣品1）蛋白質(zhì)分離完全通過(guò)ITP分離；2）在48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行質(zhì)譜分析。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑3.1實(shí)驗(yàn)器材離心機(jī)稱重器顯微鏡pH計(jì)電泳系統(tǒng)熒光掃描分析系統(tǒng)質(zhì)譜分析儀3.2實(shí)驗(yàn)試劑細(xì)胞破碎試劑盒草酸NaOHNa2CO3BSAPBSTritonX-100SDSPMSFTGN四、參考文獻(xiàn)K.D.Brown,P.A.SinghandR.A.Colyer,（2008）.Anovelmethodofproteinextractionfromrecalcitrantfruitbiomass.FoodChem.,107(3):1295-1300.LiJ.,LianM.Z.,WangY.,etal.（2015）.Separationandpurificationofpeanutproteinbyultrafiltrationandreversemicelles[J].Sep.

Purif.Technol.,139(8):114-119.YuanZ.,WangM.（2015）.Biochemicalcharacteristicsandfunctiolizationofpeanutprotein[J].J.Agric.FoodChem.,63:4977-4985.李錚（2010）.蛋白質(zhì)提取及分離技術(shù).激光雜志,31（4）：34-38。MartinV.S.,LueJ.L.（2011）.