羥苯磺酸鈣對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的影響

羥苯磺酸鈣對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的影響

糖尿病性視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙是糖尿病視網(wǎng)膜病變的基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠41只,體質(zhì)量160~190g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)室,室溫20~25℃,相對(duì)濕度40%~70%,換氣次數(shù)10~15次/h,12h光照,晝夜循環(huán)。動(dòng)物顆粒飼料喂養(yǎng),自由攝食飲水。1.2羥苯磺酸鈣膠囊、羥苯磺酸鈣膠囊、二通道克氏原螯蝦一種高效液相鏈脲佐菌素(Sigma公司,貨號(hào)S0130);胰蛋白酶(規(guī)格1∶250,Amresco公司,貨號(hào)1443C193);羥苯磺酸鈣膠囊,規(guī)格0.5g/6粒,奧地利依比威藥品有限公司,產(chǎn)品批號(hào)CD6512,用時(shí)配成33.4mg/mL水溶液;復(fù)方血栓通膠囊,規(guī)格0.5g/粒,廣東眾生藥業(yè)股份有限公司,產(chǎn)品批號(hào)110401,用時(shí)配成0.105g/mL水溶液。1.3pcr引物、儀器和儀器TotalRNA提取試劑盒(批號(hào)0960602)、qPCR試劑盒(批號(hào)0960212),北京曠博生物技術(shù)有限公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部合成。美國(guó)BIO-RADC1000PCR擴(kuò)增儀反轉(zhuǎn)錄儀,Real-TimePCR儀(AB公司),美國(guó)BIO-RAD7218R04420凝膠成像系統(tǒng)。日立H-600電子顯微鏡。尼康公司NIS-ElementsBR3.1圖像分析系統(tǒng)。2方法2.1糖尿病模型的誘導(dǎo)SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,禁食12h,鏈脲佐菌素溶解于0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(冰盒中新鮮配制,pH4.5),隨機(jī)選取30只大鼠以65mg/kg一次性ip鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型。另設(shè)11只作為對(duì)照組,注射等量的溶劑(0.1mmol/L檸檬酸鈉溶液,pH4.5)。一周后尾靜脈采血檢測(cè)血糖,以禁食6h血糖≥16.7mmol/L者為糖尿病模型。20周后抽取糖尿病模型大鼠和對(duì)照組大鼠各1只,取視網(wǎng)膜行電鏡觀察,確定視網(wǎng)膜病變形成,將糖尿病模型大鼠按體質(zhì)量和血糖隨機(jī)分為模型組、復(fù)方血栓通組(1.05g/kg,相當(dāng)于臨床用藥量的14倍)和羥苯磺酸鈣組(0.334g/kg,相當(dāng)于臨床用藥量的14倍),另設(shè)對(duì)照組,均ig給藥,1次/d,對(duì)照組給予等劑量蒸餾水,共12周。2.2實(shí)時(shí)熒光定量pcrrt-pcr方法檢測(cè)cag-t-t-t-pb-t-b2.2.1Real-timePCR法檢測(cè)Ⅳ型膠原及VEGF在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)1%戊巴比妥鈉注射液(50mg/kg)ip麻醉大鼠,取出左側(cè)眼球,沿角膜緣剪開眼球,去除角膜、晶狀體和玻璃體,用眼科刀及彎鑷將視網(wǎng)膜取出,迅速放入液氮中冷凍,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中儲(chǔ)存。Trizol一步法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:總RNA3μg,OligodT1μL,dNTP2μL,5×Buffer4μL,逆轉(zhuǎn)錄酶1μL,加入經(jīng)DEPC處理過(guò)的無(wú)菌水至20μL;反應(yīng)條件:42℃反應(yīng)1h,70℃5min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。從GenBank獲得目的基因mRNA的全長(zhǎng)序列,利用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物序列。經(jīng)過(guò)Blast分析,引物序列具有特異性。以β-actin為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)。引物序列:β-actin上游5′-CAGCCATGTACGTAGCCATC-3′,下游5′-AGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′;Ⅳ型膠原上游:5′-CCACAGATATCCGGTTCGCCTACA-3′;下游:5′-GCACACCCCACAGCCAGCACTAT-3′;VEGF上游5′-TAGACCTCTCACCGGAAAGAC-3′,下游5′-CAGGAATCCCAGAAACAAAAC-3′。反應(yīng)體系:cDNA1μL,mix5μL,引物0.8μL,Rox0.2μL,加DEPC水至10μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,58℃退火1min,72℃延伸30s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,讀取每份樣品中目的基因的Ct值,并與其β-actin基因的Ct值相減得出相對(duì)Ct值,以第1個(gè)相對(duì)Ct值為基線,后面的相對(duì)Ct值對(duì)其進(jìn)行減法運(yùn)算,得出n值后進(jìn)行相對(duì)運(yùn)算,運(yùn)算法則為1/22.2.2視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)觀察大鼠麻醉后,取大鼠右側(cè)眼球,將眼球從睫狀體后部經(jīng)鋸齒緣環(huán)形剪開虹膜,去除晶狀體和眼前節(jié)部分,將后眼杯以視盤為中心橘瓣樣剪成3塊,取1塊固定于4%多聚甲醛液72h,固定后放入0.01mmol/LPBS浸泡過(guò)夜,12h后將視網(wǎng)膜放入3%胰蛋白酶液中37℃消化3~4h,取出后放入蒸餾水中反復(fù)輕柔吹打,將透明的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)平鋪于潔凈的載玻片上,自然晾干,進(jìn)行PAS染色。光鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)學(xué)改變,采集圖像后對(duì)視網(wǎng)膜血管鋪片進(jìn)行圖像分析,測(cè)定視網(wǎng)膜毛細(xì)血管面積密度。2.2.3樣品的電鏡觀察大鼠麻醉后,取大鼠右側(cè)眼球,從睫狀體后部經(jīng)鋸齒緣環(huán)形剪開虹膜,去除晶狀體和眼前節(jié)部分,將后眼杯以視盤為中心橘瓣樣剪成3塊,取其中1塊置于2.5%戊二醛4℃固定;切取視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)組織2mm2.3統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析比較,計(jì)量資料采用ue003±s表示,多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析。3結(jié)果3.1各組大鼠vegfmrna表達(dá)比較與對(duì)照組比較,糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜組織Ⅳ型膠原mRNA表達(dá)升高(P<0.05),VEGFmRNA表達(dá)升高(P<0.001)。與模型組比較,羥苯磺酸鈣組、復(fù)方血栓通組Ⅳ型膠原mRNA和VEGFmRNA表達(dá)均降低(P<0.05)。結(jié)果見表1。3.2血管面積密度模型組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管增生,排列紊亂,內(nèi)皮細(xì)胞增生,周細(xì)胞減少,與對(duì)照組比較,毛細(xì)血管面積密度顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);羥苯磺酸鈣組、復(fù)方血栓通組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的分布較為均勻,血管增生不明顯,形態(tài)較規(guī)則,內(nèi)皮細(xì)胞增生不明顯。與模型組比較,毛細(xì)血管面積密度下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2、圖1。3.3大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞水腫的變化對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管腔規(guī)則,內(nèi)皮細(xì)胞緊靠管腔面,基底膜連續(xù)、無(wú)增厚。模型組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)吞飲小泡增多,部分線粒體腫脹,基底膜增厚較為明顯。羥苯磺酸鈣組、復(fù)方血栓通組大鼠視網(wǎng)膜血管基底膜增厚不明顯,內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密,管腔較為平滑。見圖2。4糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管并發(fā)癥的變化情況糖尿病視網(wǎng)膜病變是指長(zhǎng)期慢性高血糖使視網(wǎng)膜血管發(fā)生進(jìn)行性的結(jié)構(gòu)和功能的損害所導(dǎo)致的視網(wǎng)膜微血管病變。長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)極易造成血–視網(wǎng)膜屏障受損,使全血黏度增高,血流速度減慢,視網(wǎng)膜毛細(xì)血管狹窄、閉塞,微循環(huán)障礙,導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血缺氧視網(wǎng)膜毛細(xì)血管主要由周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成,對(duì)維持視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的穩(wěn)定性具有十分重要的作用。視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞的喪失是糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谔卣餍圆±砀淖?。周?xì)胞具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生血管生長(zhǎng)、毛細(xì)血管血流、通透性及穩(wěn)定性等多種功能。周細(xì)胞缺失,繼而引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,血管增生。視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的定性和定量研究可以用來(lái)評(píng)估糖尿病微血管病變的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)視網(wǎng)膜消化鋪片觀察到糖尿病大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管排列紊亂,內(nèi)皮細(xì)胞增生,周細(xì)胞減少,毛細(xì)血管面積密度增加;而羥苯磺酸鈣組、復(fù)方血栓通組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管形態(tài)相對(duì)規(guī)則,內(nèi)皮細(xì)胞的增生不明顯,毛細(xì)血管面積密度顯著下降,說(shuō)明羥苯磺酸鈣可以抑制毛細(xì)血管和內(nèi)皮細(xì)胞的增生,減少周細(xì)胞的凋亡。電鏡觀察可見模型組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底