乙肝疫苗制備課件

乙肝疫苗的制備乙肝疫苗的制備1乙肝疫苗的概念乙肝疫苗是用于預(yù)防乙肝的特殊藥物。疫苗接種后，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這種抗體存在于人的體液之中，乙肝病毒一旦出現(xiàn)，抗體會立即作用，將其清除，阻止感染，并不會傷害肝臟，從而使人體具有了預(yù)防乙肝的免疫力，從而達(dá)到預(yù)防乙肝感染的目的。接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染的最有效方法。

乙肝疫苗的概念乙肝疫苗是用于預(yù)防乙肝的特殊藥物。疫苗接種后，2乙肝疫苗的發(fā)展史乙肝疫苗形成于1986年，為了得到乙肝疫苗，研究人員從研究復(fù)試病毒，到酵母，并研究純化的蛋白質(zhì)序列。并經(jīng)過了大量的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。1991年，疫苗被應(yīng)用于高危險人群。主要是一些兒童，因為兒童的感染率極高。2005年，美國推行常規(guī)的疫苗注射。給所有未注射過乙肝疫苗的兒童注射。治療性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的機(jī)體中，通過誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答，達(dá)到治療或防止疾病惡化的天然、人工合成或用基因重組技術(shù)表達(dá)的產(chǎn)品或制品乙肝疫苗的發(fā)展史乙肝疫苗形成于1986年，為了得到乙肝疫苗，3乙肝疫苗的制備目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗--重組酵母乙肝疫苗和重組CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即一種乙肝病毒外衣殼蛋白，并非完整病毒。這種表面抗原不含有病毒遺傳物質(zhì)，不具備感染性和致病性，但保留了免疫原性，即刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的能力。乙肝表面抗原曾經(jīng)是從乙肝病毒攜帶著的血液，經(jīng)純化滅活等嚴(yán)格工序制備而來，即血源性疫苗，該疫苗由于安全、來源和成本等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪費大量的血基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的，即構(gòu)建含有乙肝表面抗原基因的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染相應(yīng)的宿主細(xì)胞，如酵母、CHO細(xì)胞，生產(chǎn)乙肝表面抗原蛋白。利用重組酵母生產(chǎn)的叫重組酵母乙肝疫苗，利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的叫重組CHO乙肝疫苗，劑量為每支5微克。它們都可以用于預(yù)防所有已知亞型的乙肝病毒感，都可以放心選用。乙肝疫苗的制備目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗--重組酵母乙4基因工程乙肝疫苗是乙肝表面抗原（HbsAg）亞單位疫苗，它系采用現(xiàn)代生物技術(shù)將乙肝病毒表達(dá)表面抗原的基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，克隆進(jìn)入啤酒酵母菌或CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）中，通過培養(yǎng)這種重組酵母菌或CHO細(xì)胞來表達(dá)乙肝表面抗原亞單位。發(fā)酵后經(jīng)過細(xì)胞破碎和一系列微濾、超濾、硅膠吸附、洗脫等工序，再經(jīng)過疏水層析，可使產(chǎn)品抗原蛋白純度達(dá)99%以上?；蚬こ桃腋我呙缡且腋伪砻婵乖℉bsAg）亞單位疫苗，它系5乙肝疫苗的制造工藝1.目的基因的獲取2.工程菌的構(gòu)建3.目的基因的表達(dá)4.蛋白質(zhì)的分離純化乙肝疫苗的制造工藝1.目的基因的獲取6目的基因的獲取編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取一般目的基因的獲取方法有:cDNA文庫法,化學(xué)合成法,反轉(zhuǎn)錄法目的基因的獲取編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取7工程菌的選擇CHO細(xì)胞的特點①具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能,表達(dá)的糖基化藥

物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子②具有產(chǎn)物胞外分泌功能,便于下游產(chǎn)物分離純化;③具有重組基因的高效

擴(kuò)增和表達(dá)能力;④具有貼壁生長特性,且有較高的

耐受剪切力和滲透壓能力,可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng),表達(dá)水平較高;⑤CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞(fibrob2last),很少分泌自身的內(nèi)源蛋白,利于外源蛋白的后分離工程菌的選擇CHO細(xì)胞的特點8主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNAligase、質(zhì)粒DNA提取和柱式膠回收試劑盒乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒DMEM和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂質(zhì)體LipofectamineTMHBsAg血凝檢測試劑盒主要試劑9主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNAligase、質(zhì)粒DNA提取和柱式膠回收試劑盒乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒DMEM和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂質(zhì)體LipofectamineTMHBsAg血凝檢測試劑盒主要試劑10編碼乙型肝炎表面抗原的基因PCR擴(kuò)增提質(zhì)粒與表達(dá)載體連接目的基因與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中表達(dá)編碼乙型肝炎表面抗原的基因PCR擴(kuò)增提質(zhì)粒與表達(dá)載體連接目的11蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化12固液分離離心沉淀膜過濾雙水相萃取濃縮與初步純化離子交換層析疏水層析親和層析高度純化DNA的去除熱原質(zhì)的去除病毒的去除固液分離13分離純化的基本要求技術(shù)條件溫和，保持其生物活性選擇性好，達(dá)到有效分離純化的目的技術(shù)間可以直接連接，節(jié)省工藝步驟收率高，過程快選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇根據(jù)分離單元之間的銜接來選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇分離純化的基本要求14分離純化的流程疏水柱層析陰離子交換層析凝膠過濾層析分離純化的流程疏水柱層析151、發(fā)酵液的預(yù)處理連續(xù)高速離心，除去細(xì)胞殘片，再超濾濃縮2、疏水柱層析介質(zhì)：ButylSSepharoseFF加入適量硫酸銨，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率與柱層析平衡液電導(dǎo)率相等按照平衡柱床、上樣吸附、平衡液洗柱、降低硫酸銨濃度解析、清柱再生程序?qū)游鲆腋我呙缰苽鋚pt課件163、陰離子交換柱層析介質(zhì)：DEAESepharoseFFHBsAg活性蛋白經(jīng)SephadexG-25柱脫鹽換液，使緩沖鹽系統(tǒng)的PH、離子強(qiáng)度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄樣吸附、氯化鈉濃度梯度分段洗脫、