發(fā)酵過(guò)程控制與優(yōu)化課件

5.發(fā)酵過(guò)程控制與優(yōu)化

狹義的發(fā)酵是指在厭氧條件下葡萄糖通過(guò)酵解途徑生成乳酸或乙醇等的分解代謝過(guò)程。廣義則將發(fā)酵看做是微生物把一些原料養(yǎng)分在合適的發(fā)酵條件下經(jīng)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)變成所需產(chǎn)物的過(guò)程。5.發(fā)酵過(guò)程控制與優(yōu)化

狹義的發(fā)酵是指在厭氧條件下葡萄糖通過(guò)15.1發(fā)酵過(guò)程技術(shù)原理

微生物發(fā)酵受諸多因素影響，各種因素相互制約，故必須掌握發(fā)酵代謝規(guī)律，微生物與其周圍環(huán)境的相互作用和運(yùn)用分子生物學(xué)的原理來(lái)操縱代謝物流。微生物發(fā)酚過(guò)程可分為分批、補(bǔ)料-分批、半連續(xù)和連續(xù)等幾種方式。5.1發(fā)酵過(guò)程技術(shù)原理

微生物發(fā)酵受諸多因素影響，各種因素相2

分批發(fā)酵：是一種準(zhǔn)封閉式系統(tǒng)，種子接種到培養(yǎng)基后除了氣體流通外發(fā)酵液始終留在生物反應(yīng)器內(nèi)。補(bǔ)料-分批發(fā)酵：是在分批發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入新鮮料液，以克服由于養(yǎng)分的不足，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)早結(jié)束。半連續(xù)發(fā)酵：在補(bǔ)料-分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上加上間歇放掉部分發(fā)酵液便可稱為半連續(xù)發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵：是指發(fā)酵過(guò)程中一面補(bǔ)入新鮮的料液，一面以相同的流速放料，維持發(fā)酵液原來(lái)的體積。

分批發(fā)酵：是一種準(zhǔn)封閉式系統(tǒng)，種子接種到培養(yǎng)基后除了氣體流35.2發(fā)酵條件的影響及其控制

常規(guī)的發(fā)酵條件有:罐溫、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、空氣流量、罐壓、液位、補(bǔ)料、加糖、油或前體，通氨速率以及補(bǔ)水等。能表征過(guò)程性質(zhì)的狀態(tài)參數(shù)有:pH、溶氧、溶解二氧化碳、氧化還原電位、尾氣中的氧和二氧化碳含量、基質(zhì)或產(chǎn)物濃度、代謝中間體或前體濃度、菌濃等。培養(yǎng)基對(duì)養(yǎng)分的需求：碳源、氮源、礦物鹽、特殊養(yǎng)分、復(fù)合培養(yǎng)基。5.2發(fā)酵條件的影響及其控制

常規(guī)的發(fā)酵條件有:罐溫、攪拌轉(zhuǎn)45.3泡沫對(duì)發(fā)酵的影響及其控制

5.3.1泡沫的產(chǎn)生及其影響發(fā)酵過(guò)程中因通氣攪拌與發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳以及發(fā)酵液中糖、蛋白質(zhì)和代謝物等穩(wěn)定泡沫的物質(zhì)的存在，使發(fā)酵液含有一定數(shù)量的泡沫。泡沫的存在可以增加氣液接觸表面，有利于氧的傳遞。但也給發(fā)酵帶來(lái)許多負(fù)作用，主要表現(xiàn)在:①降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)。②增加了菌群的非均一性。③增加了污染雜菌的機(jī)會(huì)。④大量起泡，控制不及時(shí)，會(huì)引起產(chǎn)物的流失。③消泡劑的加入有時(shí)會(huì)影響發(fā)酵或給提煉工序惹來(lái)麻煩。5.3泡沫對(duì)發(fā)酵的影響及其控制

5.3.1泡沫的產(chǎn)生及其影響55.3.2發(fā)酵過(guò)程中泡沫的消長(zhǎng)規(guī)律發(fā)酵過(guò)程中泡沫的多寡與通氣攪拌的劇烈程度和培養(yǎng)基的成分有關(guān)。玉米漿、蛋白陳、花生餅粉、黃豆餅粉、酵母粉、糖蜜等是發(fā)泡的主要因素。其起泡能力隨品種、產(chǎn)地、加工、貯藏條件而有所不同，還與配比有關(guān)。此外，培養(yǎng)基的滅菌方法、滅菌溫度和時(shí)間也會(huì)改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，從而影響培養(yǎng)基的起泡能力。5.3.2發(fā)酵過(guò)程中泡沫的消長(zhǎng)規(guī)律65.3.3泡沫的控制泡沫的控制方法可分為機(jī)械消沫和消泡劑兩大類。機(jī)械消沫：是指借機(jī)械引力引起的劇烈振動(dòng)或壓力變化而起到的消沫作用。消泡劑消沫：發(fā)酵工業(yè)常用的消泡劑分為天然油脂類、聚醚類、高級(jí)醇類和硅樹(shù)脂類。常用的天然油脂有玉米油、豆油、米糠油、棉籽油、魚油和豬油等，除作消泡劑外，還可作為碳源。5.3.3泡沫的控制75.4.發(fā)酵終點(diǎn)的判斷與自溶的監(jiān)測(cè)

5.4.1發(fā)酵終點(diǎn)的判斷發(fā)酵類型的不同，要求達(dá)到的目標(biāo)也不同，因而對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)有所不同。判斷放罐的指標(biāo)主要有產(chǎn)物濃度、過(guò)濾速度、菌絲形態(tài)、氨基氮、pH、DO、發(fā)酵液的粘度和外觀等。對(duì)抗生素發(fā)酵，老品種抗生素發(fā)酵放罐時(shí)間一般都按作業(yè)計(jì)劃進(jìn)行。但在發(fā)酵異常情況下，放罐時(shí)間就需當(dāng)機(jī)立斷，以免倒罐。新品種發(fā)酵更需探索合理的放罐時(shí)間。5.4.發(fā)酵終點(diǎn)的判斷與自溶的監(jiān)測(cè)

5.4.1發(fā)酵終點(diǎn)的判斷85.4.2自溶的監(jiān)測(cè)發(fā)酵后期密切監(jiān)視菌的自溶情況對(duì)穩(wěn)產(chǎn)和提高下游工段的產(chǎn)物回收率有重要意義。通常把微生物因養(yǎng)分的缺乏或處在不利的生長(zhǎng)環(huán)境下受其自身的作用開(kāi)始裂解的過(guò)程稱為自溶。研究酵母的自溶的基本過(guò)程與內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化證實(shí)了蛋白質(zhì)水解是自溶的基本動(dòng)力。而細(xì)胞壁的降解是次要的。造成自溶的外源因素有:化學(xué)物質(zhì)，如高濃度乙醇、碳氮源或氧的缺乏。5.4.2自溶的監(jiān)測(cè)95.5發(fā)酵染菌的防治及處理

5.5.1染菌的途徑分析染菌的途徑不外有以下兒方面:種子包括進(jìn)罐前菌種室階段出問(wèn)題;培養(yǎng)基的配制和滅菌不徹底;設(shè)備上特別是空氣除菌不徹底和過(guò)程控制操作上的疏漏。5.5.2染菌的判斷和防治雜菌的發(fā)現(xiàn)，常用鏡檢或無(wú)菌試驗(yàn)方法，這是確認(rèn)染菌的依據(jù)。從一些狀態(tài)參數(shù)，如DO變化的規(guī)律也可作為染菌預(yù)報(bào)的根據(jù)。遇到早期染菌，原則上可適當(dāng)改變生長(zhǎng)參數(shù)，使有利于生產(chǎn)菌而不利于雜菌的生長(zhǎng)，如降低發(fā)酵溫度等。加人某些抑制雜菌的化合物也不失為一種急辦法，條件是這種化合物對(duì)生產(chǎn)菌無(wú)害對(duì)生產(chǎn)影響不大和在下游精制階段能被完全去除。中后期染菌除非是噬菌體，通常后果不會(huì)那么嚴(yán)重，這時(shí)發(fā)酵液中己產(chǎn)生一定濃度的抗生素，對(duì)雜菌已有一定抑制作用。實(shí)際生產(chǎn)中常采用大接種量的原因之一是即使不慎污染了極少量雜菌，生產(chǎn)菌也能很快占優(yōu)勢(shì)。5.5發(fā)酵染菌的防治及處理

5.5.1染菌的途徑分析105.6基因工程菌培養(yǎng)與表達(dá)蛋白在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)上的應(yīng)用分4個(gè)方面:即疾病或感染的預(yù)防;臨床疾病的治療;抗體存在的診斷和新療法的發(fā)現(xiàn)。這方面研究的重點(diǎn)著眼于應(yīng)用克隆基囚來(lái)生產(chǎn)一些稱之為生物制品的蛋白，如疫苗、診斷工具和激素等。利用重組DNA技術(shù)來(lái)生產(chǎn)蛋白有4方面的理由:①品種的需求②數(shù)量上的滿足③安全④具有特異性5.6基因工程菌培養(yǎng)與表達(dá)蛋白在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)上的應(yīng)用分4個(gè)方11胰島素：在1982年由大腸桿菌生產(chǎn)的胰島素成為第一個(gè)獲執(zhí)照的重組體衍生的人用生物制品。胰島素是用來(lái)治療I型糖尿病患者。這種病人的胰島自己不能生成足夠的胰島素，需依賴外源供給。生長(zhǎng)激素：兒童的生長(zhǎng)和體重的增加要靠其生長(zhǎng)激素，這是一種垂體產(chǎn)物。促紅細(xì)胞生成素：是一種為響應(yīng)低氧而由腎臟產(chǎn)生的激素，它在骨髓中負(fù)責(zé)促進(jìn)紅血球細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。親甲醇酵母：畢赤酵母是生產(chǎn)外源蛋白的最佳寄主之一，因它具有很強(qiáng)的受甲醇誘導(dǎo)的AOXI啟動(dòng)子。胰島素：在1982年由大腸桿菌生產(chǎn)的胰島素成為第一個(gè)獲執(zhí)照的12白細(xì)胞介素:是一類具有激活、增殖、成熟和分化機(jī)體免疫細(xì)胞，抗病毒、抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的細(xì)胞因子。全球氨基酸的年產(chǎn)量估計(jì)在50~80萬(wàn)噸，其中2/3用于食品，其余大部分作動(dòng)物詞料添加劑用，還有相當(dāng)數(shù)量用于醫(yī)藥工業(yè)和作為合成化學(xué)試劑的前體。重組DNA技術(shù)已成功地應(yīng)用于提高棒桿菌和其他工業(yè)生產(chǎn)菌種的氨基酸生產(chǎn)。全球的微生物多糖的產(chǎn)值估計(jì)已超過(guò)10億美元。這類生物高分子屬于膠體，其獨(dú)特功能在于它們可作為增稠劑、親水膠體，用于水基系統(tǒng)中的乳化、懸浮和穩(wěn)定混合物。它們?cè)跍囟?、pH和鹽濃度大幅度變化的條件下仍能與其他系統(tǒng)相容，甚至起協(xié)同增效作用。白細(xì)胞介素:是一類具有激活、增殖、成熟和分化機(jī)體免疫細(xì)胞，抗13胰島素的生產(chǎn)胰島素的生產(chǎn)14簡(jiǎn)介

胰島素(Insulin)是糖尿病，尤其是I型糖尿病的特效藥物，可以促進(jìn)血液中葡萄糖的利用而降低血糖，并調(diào)節(jié)糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝。WHO相關(guān)資料表明：糖尿病已成為繼心血管疾病、腫瘤之后的第3位主要疾病，嚴(yán)重威脅全人類健康，全球共有糖尿病患者1.75億人，中國(guó)糖尿病患者9200萬(wàn)人，已超越印度成為亞洲第一大國(guó)。2002年到2012年的十年間，全球胰島素的銷售額年復(fù)合增長(zhǎng)率達(dá)14.5%；2010年全球胰島素藥物的銷售額超過(guò)145億美元，因此胰島素藥物的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)具有重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。簡(jiǎn)介胰島素(Insulin)是糖尿病，尤其是I型糖尿病的15人胰島素是利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)出來(lái)的。是利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)與天然胰島素有相同的結(jié)構(gòu)和功能?？烧{(diào)節(jié)糖代謝，促進(jìn)肝臟、骨骼和脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)樘窃A存于肌肉和肝臟內(nèi)，并抑制糖原異生。人胰島素是利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)出來(lái)的。是利用重組DNA技術(shù)16生產(chǎn)企業(yè)丹麥諾和諾德、美國(guó)禮來(lái)、中國(guó)通化東寶、深圳科興、徐州萬(wàn)邦。美國(guó)的禮來(lái)和丹麥的諾和諾德是目前向市場(chǎng)供應(yīng)基因工程胰島素的主要廠家，他們分別研究和利用大腸桿菌和酵母生產(chǎn)人胰島素。這兩個(gè)系統(tǒng)各有利弊，一般講，大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)效率高，但后處理較難。酵母系統(tǒng)表達(dá)量雖然比較低，但對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的處理較簡(jiǎn)便。生產(chǎn)企業(yè)丹麥諾和諾德、美國(guó)禮來(lái)、中國(guó)通化東寶、深圳科興、徐州17醫(yī)用的胰島素

醫(yī)用的胰島素主要有兩種，一種是從動(dòng)物臟器中生化提取的動(dòng)物胰島素，如豬胰島素、牛胰島素等，動(dòng)物臟器中生化提取產(chǎn)量低、成本高（100公斤動(dòng)物胰腺只能提取4-5克胰島素，一個(gè)病人所需胰島素要從40頭牛或50頭豬的胰腺中提?。?、純度低，療效差；一種是通過(guò)基因工程手段的人胰島素，基因重組人胰島素純度高、療效好醫(yī)用的胰島素醫(yī)用的胰島素主要有兩種，一種是從動(dòng)物臟器中生化18生產(chǎn)方法胰島素的生產(chǎn)方法主要有兩種，一種是從動(dòng)物臟器中生化提取的動(dòng)物胰島素，如豬胰島素、牛胰島素等，動(dòng)物臟器中生化提取產(chǎn)量低、成本高（100公斤動(dòng)物胰腺只能提取4-5克胰島素，一個(gè)病人所需胰島素要從40頭?；?0頭豬的胰腺中提取）、純度低，療效差；一種是通過(guò)基因工程手段的人胰島素，基因重組人胰島素純度高、療效好.生產(chǎn)方法胰島素的生產(chǎn)方法主要有兩種，一種是從動(dòng)物臟器中生化提19通過(guò)基因工程手段生產(chǎn)人胰島素的步驟1.提取目的基因2.提取質(zhì)粒3.基因重組4.將質(zhì)粒送回大腸桿菌5.胰島素的產(chǎn)生通過(guò)基因工程手段生產(chǎn)人胰島素的步驟1.提取目的基因201.提取目的基因

即從人的DNA中提取胰島素基因,可使用限制性內(nèi)切酶將目的基因從原DNA中分離。1.鳥(niǎo)槍法：用一大堆限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)附近基因進(jìn)行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，用DNA分子雜交，即DNA探針2.人工合成法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄蛋白或者mRNA推導(dǎo)出基因序列，然后人工合成，沒(méi)有內(nèi)含子3.從基因文庫(kù)中提取：也就是事先已經(jīng)提取完畢的拿來(lái)用。4.PCR擴(kuò)增技術(shù)：用于大量生產(chǎn)該段基因片段，用于商業(yè)化運(yùn)作。1.提取目的基因即從人的DNA中提取胰島素基因,可使用212.提取質(zhì)粒從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒,質(zhì)粒為環(huán)狀。此質(zhì)粒將作為胰島素基因的載體。

1.堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。2.煮沸裂解法：指用煮沸加熱的方法裂解菌體,以提取質(zhì)粒。

2.提取質(zhì)粒從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒,質(zhì)粒為環(huán)狀。223.基因重組

取出目的基因與質(zhì)粒,先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開(kāi),再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)?！翱p合”,形成一個(gè)能表達(dá)出胰島素的DNA質(zhì)粒。3.基因重組取出目的基因與質(zhì)粒,先利用同種限制性內(nèi)切酶234.將質(zhì)粒送回大腸桿菌

在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質(zhì),如

CaCl2,這使細(xì)胞會(huì)吸收外源基因.此時(shí)將重組的

質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中,大腸桿菌便會(huì)將重組質(zhì)粒

吸收.

將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入受體細(xì)胞