細胞生物學(xué)技術(shù)課件

細胞生物學(xué)技術(shù)

★流式細胞術(shù)

★WesternBlot

★蛋白質(zhì)芯片.*細胞生物學(xué)技術(shù).*1細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀

流式細胞儀（FlowCytometer，F(xiàn)CM)

是將流體噴射技術(shù)、激光技術(shù)、空氣技術(shù)、γ射線能譜術(shù)及電子計算機等技術(shù)與顯微熒光光度計密切結(jié)合的一種非常先進的檢測儀器。通過測量細胞及其他生物顆粒的散射光和標(biāo)記熒光強度，來快速分析顆粒的物理或化學(xué)性質(zhì)，并可以對細胞進行分類收集，可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個細胞特征參數(shù)，進行定性或定量分析，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等特點。

流式細胞儀.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀流式細胞2細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀工作原理

流式細胞儀技術(shù)，主要是測量群體中單個細胞經(jīng)適當(dāng)染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光，經(jīng)染色的細胞在懸液中以單行流過高強度光源的焦點，當(dāng)每個細胞經(jīng)過焦點時，發(fā)出一束散射光/或熒光。它們經(jīng)過過濾及光鏡系統(tǒng)收集到達一個光電檢測器(光電倍增管或一個固態(tài)裝置)，光檢測器把散射光定量轉(zhuǎn)化成電信號，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進行數(shù)字化后而成整數(shù)，然后進行電子存儲，以后數(shù)據(jù)可以調(diào)出顯示和進行分析。如左圖所示。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀工作原理.*3細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀流式細胞儀流動室和液流系統(tǒng)

激光源和光學(xué)系統(tǒng)光電管和檢測系統(tǒng)

計算機和分析系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成：除以下四個主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。

.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀流式細流動室和4細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀流動室和液流系統(tǒng)流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計和制作均很精細，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號可發(fā)生振動。液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀流動室和液流系5.*.*6.*.*7細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀光電倍增管（PMT）光電管和檢測系統(tǒng).*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀光電倍增管（PMT）8細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀光電管和檢測系統(tǒng)經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。光電倍增管（PMT）最為常用。PMT的響應(yīng)時間短，僅為ns數(shù)量級；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從10到10可連續(xù)調(diào)節(jié)，因此對弱光測量十分有利。光電管運行時特別要注意穩(wěn)定性問題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因為光譜響應(yīng)特性不同，不宜互換。從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。流式細胞計中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號輻度與輸入信號成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號以及代表生物學(xué)線性過程的信號，例DNA測量等。另一類是對數(shù)放大器，輸出信號和輸入信號之間成常用對數(shù)關(guān)系。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀光電管和檢測系統(tǒng).*9細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀計算機和分析系統(tǒng)經(jīng)放大后的電信號被送往計算機分析器。多道的道數(shù)是和電信號的脈沖高度相對應(yīng)的，也是和光信號的強弱相關(guān)的。對應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號的細胞相對數(shù)目。多道分析器出來的信號再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計算機的硬盤和軟盤上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計算機的存貯容量較大，可存貯同一細胞的6～8個參數(shù)。存貯于計算機內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實測后脫機重現(xiàn)，進行數(shù)據(jù)處理和分析，最后給出結(jié)果。細胞分選系統(tǒng).*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀計算機和分析系統(tǒng)細胞10FluorescenceActivatedCellSorting488

nm

laser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector流式細胞計的分選功能是由細胞分選器來完成的?？偟倪^程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。.*FluorescenceActivatedCellSo11細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀

數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。

數(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖、二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率單參數(shù)直方圖（Histogram）.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀數(shù)據(jù)處理原理：12二維等高圖3DPlot

二維點圖DotPlot.*二維等高圖3DPlot二維點圖DotPlot.*13細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀優(yōu)點：1、具有操作簡便，只要將染色的單個細胞推入儀器中，就會得出數(shù)據(jù)。2、具有較高的靈敏度及測定速度，而且每次可測出許多數(shù)據(jù)，一般情況下，每秒可測5000個細胞，能迅速分析和記數(shù)大量細胞，并能準(zhǔn)確統(tǒng)計群體中熒光標(biāo)記細胞的比例。3、應(yīng)用廣泛，即可用于測定細胞活力、繁殖周期和細胞定型分析，也可區(qū)別死亡細胞、分裂細胞和靜止細胞群，既可測定DNA和RNA、測凋亡峰，又可測蛋白含量，特別是胞漿蛋白。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀優(yōu)點：.*14細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀應(yīng)用：目前流式細胞儀(FCM)已在各學(xué)科中獲得應(yīng)用。細胞生物學(xué)：定量分析細胞周期并分選不同細胞周期時相的細胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表達產(chǎn)物等物質(zhì)與細胞增殖周期的關(guān)系，進行染色體核型分析，并可純化X或Y染色體,等等。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀應(yīng)用：.*15細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀

例如流式細胞儀檢測細胞凋亡—AnnexinV/PI雙染色法

AnnexinV/PI標(biāo)記染色：取500u1心肌緩沖液，輕輕混勻細胞后加5ulFITC一AmexinV和5ulPI試劑，置冰浴10min后，流式細胞儀(光源為488nm氨離子激光，預(yù)先用Flow-Check調(diào)整光路)計數(shù)104以上的細胞，用FITC/PI雙色分析程序測得心肌凋亡細胞(AnnexinV＋/PI—)的百分率。雙陰：活細胞AnnexinV-PE單陽：早期凋亡細胞雙陽：晚期凋亡細胞7-AADd單陽：壞死細胞.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—流式細胞儀例16細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlotWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。

原理.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlotWeste17細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlotWesternblot步驟示意圖步驟.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlotWeste18細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot一、蛋白樣品的提取通過有機溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。有機溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot一、蛋白樣19細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot蛋白樣品的定量1.雙縮脲法：在需要快速，但不很準(zhǔn)確的測定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對蛋白質(zhì)提純的早期階段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍色絡(luò)合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質(zhì)緩沖液，可用沉淀法除去干擾物。2.Lowry法：第一步Cu2+與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物，然后這個絡(luò)合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），得到深藍色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液。其干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質(zhì)的存在會使結(jié)果嚴(yán)重偏差。3．電泳估算法:樣品倍比稀釋，SDS電泳，同時做定量marker對照，可以估算樣品大概濃度..*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot蛋白樣品的20細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot4.紫外吸收法：大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，利用這個特異性吸收，可以計算蛋白質(zhì)的含量。如果沒有干擾物質(zhì)的存在，在280nm處的吸收可用于測定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質(zhì)溶液。部分純化的蛋白質(zhì)常含有核酸，核酸在260nm波長處有最大吸收。有核酸時，所測得的蛋白質(zhì)濃度必須作適當(dāng)校正。5.Bradford比色法:Bradford比色法比Lowry法測定蛋白濃度更簡單迅速。用脫氧膽酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污劑、2-巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、Tris和一些堿性緩沖系統(tǒng)的干擾。蛋白樣品的定量.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot4.紫外吸21細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot二、SDS22細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot三、樣品的印記--轉(zhuǎn)膜半干轉(zhuǎn)移法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣夾在用緩沖液濕潤濾紙間。－|紙|膠|膜|紙|＋槽式濕轉(zhuǎn)法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。

－|海綿|紙|膠|膜|紙|海綿|＋半干轉(zhuǎn)移法濕轉(zhuǎn)法.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot三、樣品的23細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot四、封閉將轉(zhuǎn)印膜浸泡到封閉液中，將膜上沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的區(qū)域結(jié)合上蛋白質(zhì)，目的是使抗體與特異的蛋白質(zhì)結(jié)合。封閉液：5%脫脂奶粉或BSA（室溫孵育1h）WesternBlot膜封閉液Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。搖床上緩慢搖動封閉，室溫2h或4℃過夜。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot四、封閉24細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot五、一抗、二抗孵育與洗膜把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜?；厥找豢谷芤海肨BST漂洗膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育1-2小時或4℃過夜?；厥找豢谷芤海肨BST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot五、一抗、25細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot六、反應(yīng)顯色重組蛋白一般用AP顯色或是DAB顯色，裂解液一般用發(fā)光法

辣根過氧化物酶法（HRP）：HRP標(biāo)記二抗用DAB顯色，按順序依次將DAB三種劑各取3滴于5ml蒸餾水中，避光混勻，將膜加入顯色液中避光顯色5-15min終止反應(yīng)，對照Marker記錄實驗結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存。堿性磷酸酶法（AP）：AKP標(biāo)記二抗用AP顯色，在10mlAKP緩沖液中加入66μlNBT溶液和33μl

BCIP溶液混勻，室溫下將膜放入顯色（37℃可加速反應(yīng)）5-15min。對照Marker記錄實驗結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存。

3.化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)：將兩種顯色底物1：1等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時間根據(jù)光的亮度來衡量），顯影、定影。（熒光在一段時間后會越來越弱要控制好時間）。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot六、反應(yīng)顯26細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot七、結(jié)果分析目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot七、結(jié)果分27細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot它結(jié)合了凝膠分辨力高和固相免疫測定的特異敏感等多種優(yōu)點，與免疫沉淀法比較，這種方法無需對靶蛋白進行同位素標(biāo)記。幾乎總在變性條件下進行，可以避免溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等諸多問題。具有從混雜抗原中檢測出特定抗原，或從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性，還可以對轉(zhuǎn)移到固相膜上的蛋白質(zhì)進行連續(xù)分析，具有蛋白質(zhì)反應(yīng)均一性，固相膜保存時間長等優(yōu)點。被廣泛地用于蛋白質(zhì)研究，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。優(yōu)點.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot它結(jié)合了凝28細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot應(yīng)用目的蛋白的表達特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達量分析.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—WesternBlot應(yīng)用目的29細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片中文名稱：蛋白質(zhì)芯片英文名稱：proteinchip其他名稱：蛋白質(zhì)微陣列(proteinmicroarray)蛋白質(zhì)芯片是指固定于支持介質(zhì)上的蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。又稱蛋白質(zhì)微陣列(Proteinmiogrorray)，最早是在生物功能基因組學(xué)研究中繼基因芯片之后，作為基因芯片功能的補充發(fā)展起來的。是在一個基因芯片大小的載體上，按使用目的的不同，點布相同或不同種類的蛋白質(zhì)，然后再用標(biāo)記了熒光染料的蛋白質(zhì)結(jié)合，掃描儀上讀出熒光強弱，計算機分析出樣本結(jié)果。簡介.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片中文名稱：蛋白質(zhì)芯30細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片Pro芯片原理蛋白芯片技術(shù)的研究對象是蛋白質(zhì)，其原理是對固相載體進行特殊的化學(xué)處理，再將已知的蛋白分子產(chǎn)物固定其上(如酶、抗原、抗體、受體、配體、細胞因子等)，根據(jù)這些生物分子的特性，捕獲能與之特異性結(jié)合的待測蛋白(存在于血清、血漿、淋巴、間質(zhì)液、尿液、滲出液、細胞溶解液、分泌液等)，經(jīng)洗滌、純化，再進行確認和生化分析；它為獲得重要生命信息(如未知蛋白組分、序列。體內(nèi)表達水平生物學(xué)功能、與其他分子的相互調(diào)控關(guān)系、藥物篩選、藥物靶位的選擇等)提供有力的技術(shù)支持。.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片Pro芯片原理.31細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)微陣列

微孔板蛋白芯片

三維凝膠塊芯片分類.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)微陣列分32細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片Pro芯片的具體制備方法1.固相載體及其處理載體（滴定板、濾膜、凝膠、載玻片）

2.蛋白質(zhì)的預(yù)處理選擇具有較高純度和完好生物活性的蛋白進行溶解3.點制微陣列可使用點制基因微陣列的商品化點樣儀或噴墨法等4.固定微陣列上的蛋白樣點膜為載體：芯片放入濕盒，37°C1h載玻片為載體：化學(xué)修飾產(chǎn)生醛基固定蛋白5.微陣列的封閉主要封閉試劑：BSA（牛血清白蛋白）或Gly（甘氨酸）.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片Pro芯片的具體33細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片的檢測法1.探針標(biāo)記檢測法（S）2.無探針標(biāo)記檢測法3.動態(tài)分析檢測法（S）.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片的檢測法34細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片

同位素標(biāo)記檢測熒光標(biāo)記檢測化學(xué)發(fā)光檢測酶免疫標(biāo)記檢測膠體金標(biāo)記檢測1.探針標(biāo)記檢測法（S）.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片同位素標(biāo)記檢測135細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片2.無探針標(biāo)記檢測法表面增強激光解吸離子化技術(shù)(Surfaceenhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)表面等離子體共振檢測技術(shù)

（surfaceplasmonresonance,SPR）原子力顯微鏡檢測技術(shù)（atomicforcemicroscope,AFM）.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片2.無探針標(biāo)記檢36細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片表面等離子共振生物傳感器（surfaceplasmonresonance，SPR）檢測法。SPR檢測法的原理：利用表面等離子共振現(xiàn)象監(jiān)測傳感片表面介質(zhì)的折射率變化，而這一變化僅和傳感片表面結(jié)合的生物大分子的量成正比，溶液中的分子不會干擾。SPR現(xiàn)在已經(jīng)成為一個比較成熟的多方面研究受體-配基相互作用動力學(xué)的檢測工具。例如，Sapsford等發(fā)展了一個抗體芯片的生物傳感器去研究抗體作用的動力學(xué)。3.動態(tài)分析檢測法（S）.*細胞生物學(xué)技術(shù)

—蛋白質(zhì)芯片表面等離子共振生物37細胞