控制菌及螨類檢查技術(shù)-藥品中梭菌檢查

項目九控制菌檢查及螨類檢查技術(shù)任務(wù)9藥品中梭菌檢查知識點9藥品中梭菌檢查方法9.1梭菌梭菌屬去稱為棱狀芽孢桿菌屬，菌體1μm×5μm左右，革蘭陽性桿菌，能形成芽孢。芽孢多大于菌體的寬度，細(xì)菌膨脹呈梭型，故名梭狀芽孢桿菌。該菌屬中主要病原菌有產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌，均能產(chǎn)生強烈的外毒素使人和動物致病。因此，對于某些用于陰道、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品，必須控制校菌。檢查梭菌的方法主要是增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)和鏡檢形態(tài)觀察，必要時做分離培養(yǎng)后再行鑒定。9.1.1形態(tài)特征

梭菌屬為革蘭陽性菌，通常以周生鞭毛運動，個別種，如產(chǎn)氣莢膜梭菌無鞭毛，不運動，但能形成莢膜。大部分菌體呈桿狀或稍彎曲，兩端鈍圓或平直形成的芽孢比菌體寬，在菌體的中央或近端，少數(shù)菌種的芽孢在菌體頂端如鼓槌狀，但多數(shù)芽孢使菌體中部膨大呈梭形。藥品中梭菌檢查方法9.1.2培養(yǎng)特征

大多數(shù)為專性厭氧，大多數(shù)種在pH6.5～7.0,30～37℃生長最快，在庖肉培養(yǎng)基中，肉湯渾濁，肉渣部分被消化，微變黑，產(chǎn)生氣體，生成甲基硫醇及硫化氫。9.1.3生化反應(yīng)

生化反應(yīng)極不活潑，一般不發(fā)酵糖類，能液化明膠，產(chǎn)生硫化氫形成吲哚，不能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，對蛋白質(zhì)有微弱消化作用。9.1.4抵抗力

對環(huán)境抵抗力很強，有的芽孢可以在土壤中存活數(shù)十年。多數(shù)菌對磺胺藥、青霉素等較為敏感，但對新霉素，卡那霉素和多黏菌素等不敏感。藥品中梭菌檢查方法9.2檢查程序供試液的制備見“藥品中微生物總數(shù)的檢查”。陽性對照試驗：供試品進(jìn)行控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗，陽性對照試驗的加菌量為10～100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的控制菌檢查。陽性對試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陽性對照試驗的目的：檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陰性對照試驗：取稀釋劑10ml加入100ml(或200m1)相應(yīng)控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無菌生長。

陰性對照試驗的目的：檢查稀釋劑是否滿足無菌要求及培養(yǎng)條件是否適宜。藥品中梭菌檢查方法9.2.1厭氧培養(yǎng)裝置的準(zhǔn)備

除商品厭氧培養(yǎng)袋、箱、罐按使用要求準(zhǔn)備外，試驗室亦可用真空干燥器、標(biāo)本瓶或其他適宜容器替代使用，可選用下列一種方法制備厭氧條件。9.2.1.1冷觸酶法

臨用前，取試管或其他適宜容器3支,1支稱入硼酸氫鈉0.22g(以厭氧培養(yǎng)容器容積1L計),1支稱取枸櫞酸0.33g、碳酸氫鈉0.37g，另1支放入經(jīng)活化的鈀粒約1g，與接種后的供試品培養(yǎng)管(或平板)及厭氧指示劑管1支，同時置于厭氧培養(yǎng)容器，隨即各加水5m1于前2支管(或容器)中，迅速密封容器蓋。鈀粒為覆蓋鈀的氧化鋁的球狀或條狀顆粒(有商品出售)，用前須經(jīng)160℃干烤2h，或在電爐上灼燒5min使其活化。由于每用一次便失去催化性，因此，再次使用時須按上法活化后方能使用。將鈀粒若干置室溫水中，附有大量氣泡者為活性良好，可直接使用。此法可作為鈀粒的活性檢查。

藥品中梭菌檢查方法9.2.1.2焦性沒食子酸法

用前取培養(yǎng)皿或其他適宜容器1支，加入焦性沒食子酸10g及無水碳酸鈉5g(以厭氧容器容積LL計)，與接種后的供試品培養(yǎng)管(或平板)及厭氧指示劑管1支同時置于厭氧容器內(nèi)，迅速密封容器蓋9.2.2增菌培養(yǎng)

取供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g或lm)4份，其中2份置80℃保溫10min后迅速冷卻。上述4份供試液直接或處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中，其中2份(直接1份，處理后1份)校菌增菌培養(yǎng)管中分別加入陽性對照菌(10～100cfu)。置厭氧條件下培養(yǎng)48h。9.2.3分離培養(yǎng)

取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)48～72h。若供試品平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若供試品平板上有菌落生長，應(yīng)挑選2～3個菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。

藥品中梭菌檢查方法9.2.4革蘭染色鏡檢

取疑似菌落涂片，作革蘭染色、鏡檢，觀察染色及菌體特征。本菌形態(tài)特征較為典型。培養(yǎng)后形成的芽孢，初呈“火柴頭”狀卵圓形，繼而膨大呈球形，在菌體末端如鼓槌狀。培養(yǎng)時間至72h以上時，菌體可自溶而消失，僅見游離的芽泡囊，一般染色時呈圓圈狀。染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢，大于菌體，著生于菌體中央、次端或頂端，為梭菌典型形態(tài)。9.2.5過氧化氫酶試驗

加一滴3%過氧化氫溶液至瓊脂表面的單個分散的菌落，或轉(zhuǎn)移至載玻片的菌落上。有氣泡形成表示過氧化氫酶反應(yīng)陽性，梭菌應(yīng)成陰性結(jié)果，可用枯草芽孢桿菌作為陽性反應(yīng)對照菌。9.3結(jié)果判斷

若上述可疑落為革蘭陽性棱菌，有或無卵圓形成球形的芽孢，過氧化氫酶試驗陰性，判供試品檢出梭菌，否