腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)技術(shù)首都醫(yī)科大學(xué)2015.11腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)技術(shù)首都醫(yī)科大學(xué)目錄一、概述二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)三、Transwell四、裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)五、總結(jié)目錄一、概述一、概述腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移體外體內(nèi)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)Transwell裸鼠尾靜脈注射一、概述腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移體外體內(nèi)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)Transwell二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法，實(shí)驗(yàn)成本低，可以用來(lái)檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力。二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)：1.在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過(guò)程。2.適合研究細(xì)胞與胞外基質(zhì)（ECM）、細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用引起的細(xì)胞遷移。3.與包括活細(xì)胞成像在內(nèi)的顯微鏡系統(tǒng)兼容，可用于分析細(xì)胞間的相互作用。4.研究細(xì)胞遷移的體外實(shí)驗(yàn)中最簡(jiǎn)單的方法。二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)：二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞樣品儀器、耗材：6孔板marker筆直尺槍頭試劑、試劑盒：無(wú)血清培養(yǎng)基、PBS二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料：二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)1.所有能滅菌的器械都要滅菌2.超凈工作臺(tái)

紫外線消毒30min注：需要滅菌的器材包括——離心管、吸管筒、移液槍、槍頭等二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)1.所有能滅菌的器械都要滅菌二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)4.每孔加入5X105個(gè)細(xì)胞并培養(yǎng)約24h注：1.數(shù)量以過(guò)夜貼壁能鋪滿(mǎn)為宜，適當(dāng)調(diào)整

2.數(shù)量少時(shí)可培養(yǎng)一段時(shí)間至鋪滿(mǎn)板底

（3.6孔板背面畫(huà)線5-6條）二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（3.6孔板背面畫(huà)線5-6條）二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)5.用1ml槍頭垂直于孔板和線制造細(xì)胞劃痕，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致注：.人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)6.吸掉舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞后，再加入無(wú)血清培養(yǎng)基，根據(jù)需要設(shè)加實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。注：沖洗時(shí)溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細(xì)胞二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)6.吸掉舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞后7.放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，（6），12，24小時(shí)取樣，拍照。8.計(jì)算、比較、分析①imageJ軟件計(jì)算每個(gè)視野的劃痕面積②/en/二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)7.放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，（6），12，2新：德國(guó)IBIDI（易必迪）技術(shù)1.準(zhǔn)備細(xì)胞，培養(yǎng)液，cultureInsert。2.將細(xì)胞接種于Dish中間的Insert，培養(yǎng)。3.細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)Insert區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500μm寬度的劃痕。4.每隔4-6小時(shí)拍照記錄。5.根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)新：德國(guó)IBIDI（易必迪）技術(shù)1.準(zhǔn)備細(xì)胞，培養(yǎng)液，cul談幾點(diǎn)問(wèn)題：1.細(xì)胞的選擇：一般適用于上皮，纖維樣細(xì)胞系a.本身有遷移能力，且較強(qiáng)。b.有極性，方便測(cè)量，觀察。c.對(duì)無(wú)血清有較強(qiáng)的忍受力。2.觀察的時(shí)間：一般為0、6、12、24ha.時(shí)間太久，無(wú)血清，易死亡，相對(duì)堅(jiān)強(qiáng)b.時(shí)間太久，細(xì)胞繁殖，假陽(yáng)性

二、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)談幾點(diǎn)問(wèn)題：2.觀察的時(shí)間：一般為0、6、12、24h二、細(xì)三、TranswellTranswell是一種應(yīng)用Transwell小室來(lái)探究細(xì)胞共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等的問(wèn)題的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。三、TranswellTranswell是一種應(yīng)三、Transwell①Transwell小室：常用8.0um膜，鋪膠130rmb、不鋪膠40rmb，可重復(fù)利用②上層培養(yǎng)液：無(wú)血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2%BSA③細(xì)胞：有侵襲能力細(xì)胞先撤血清讓細(xì)胞饑餓12－24h，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備及說(shuō)明：三、Transwell①Transwell小室：常用8.0u三、Transwell④基質(zhì)膠：常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel⑤下層培養(yǎng)液：含5%－10%FBS的培養(yǎng)基，也可用趨化因子⑥細(xì)胞培養(yǎng)板：6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用材料準(zhǔn)備及說(shuō)明：三、Transwell④基質(zhì)膠：常用的是人工重構(gòu)基底膜材料三、Transwell1.Transwell小室制備①包被基底膜：用50mg/LMatrigel1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干②水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃，30min。三、Transwell1.Transwell小室制備三、Transwell2.取細(xì)胞懸液加入Transwell小室，24孔板小室一般200μl。細(xì)胞密度為1－10×105個(gè).3.24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。三、Transwell2.取細(xì)胞懸液加入Transwell小三、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)4.培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)48h，具體調(diào)整5.結(jié)果測(cè)定：①直接測(cè)定：細(xì)胞染色，鏡下計(jì)數(shù)②間接測(cè)定：MTT法、熒光試劑檢測(cè)、結(jié)晶紫染色問(wèn)：某藥可抑細(xì)胞侵襲，24h后可抑制細(xì)胞增殖，可以培養(yǎng)36h看結(jié)果嗎？三、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)4.培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)48h，具體調(diào)整5.結(jié)三、Transwell直接觀察：①用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞②染色：推薦采用0.1%結(jié)晶紫固定染色。③細(xì)胞計(jì)數(shù)：把小室反過(guò)來(lái)直接觀察或把膜切下直接染色，取若干個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)問(wèn)：①、②先后問(wèn)題？三、Transwell直接觀察：?jiǎn)枺孩?、②先后?wèn)題？三、Transwell間接觀察：結(jié)晶紫法①用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞②染色：推薦采用0.1%結(jié)晶紫固定染色。③染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來(lái)，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm測(cè)其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。三、Transwell間接觀察：結(jié)晶紫法四、裸鼠尾巴靜脈注射小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型分類(lèi)：1.人工轉(zhuǎn)移模型：將腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)株或腹水等行注射，在肺(尾靜脈注射)、腦(頸動(dòng)脈注射）肝臟(肝動(dòng)脈注射）等部位觀察2.自發(fā)轉(zhuǎn)移模型：腫瘤細(xì)胞接種在小鼠腋部或足趾的皮下、腹腔肌肉或原組織中，觀察轉(zhuǎn)移灶。四、裸鼠尾巴靜脈注射小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型分類(lèi)：四、裸鼠尾巴靜脈注射1.裸鼠的選擇：4-6周裸鼠、價(jià)格約100+rmb2.細(xì)胞的選擇：查閱文獻(xiàn)，選擇合適細(xì)胞株；細(xì)胞濃度：具體不定，動(dòng)物腫瘤一般接種2～600萬(wàn)/只就100%成瘤，而人癌則需要1000萬(wàn)以上才能較高的成瘤四、裸鼠尾巴靜脈注射1.裸鼠的選擇：4-6周裸鼠、價(jià)格約10四、裸鼠尾巴靜脈注射3.注射技巧：①固定：50ml離心管自制或購(gòu)買(mǎi)成品②注射位置：鼠尾部側(cè)面的2條靜脈，一般在尾部遠(yuǎn)端的1/3到1/2處進(jìn)針。③注射：選擇1-2ml注射器，針頭采用4號(hào)或4.5號(hào)。④凸顯靜脈：溫水，烤燈等四、裸鼠尾巴靜脈注射3.注射技巧：四、裸鼠尾巴靜脈注射問(wèn)：如何判斷已經(jīng)注射進(jìn)入：注射到靜脈的推液幾乎沒(méi)有阻力，可快速將液體推完通常600ul可在10秒推完。如果注射到靜脈以外，強(qiáng)行推液，阻力較大，注射處周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)露水樣滲液，而且出針后，出血較少。并且由于藥液瘀阻在尾部，導(dǎo)致血流不暢，尾部缺血，易導(dǎo)致尾部炎癥和壞死。四、裸