高效液相色譜法原理及其應(yīng)用課件

高效液相色譜法（HPLC）

主講人：周媛高效液相色譜法（HPLC）

主講人：周媛1第一節(jié)高效液相色譜法基本原理色譜分析法是分析化學(xué)中獲得廣泛應(yīng)用的一個重要分支，是一個具有強(qiáng)大生命力的分離分析技術(shù)。采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品由流動相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號，最終得到各組分的色譜峰。第一節(jié)高效液相色譜法基本原理色譜分析法是分析化學(xué)中獲得廣泛2（一）高效液相色譜法的特點(diǎn)

一、與經(jīng)典液相色譜法比較

現(xiàn)代液相色譜法是在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測器等新實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。（一）高效液相色譜法的特點(diǎn)

一、與經(jīng)典液相色譜法比較3二、與氣相色譜法比較1．分析對象的區(qū)別

GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品；但對高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品，尤其對大多數(shù)生化樣品不可檢測占有機(jī)物的20%

HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機(jī)物的80%二、與氣相色譜法比較42．流動相的區(qū)別GC：流動相為惰性氣體，組分與流動相無親合作用力，只與固定相有相互作用。HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對分離起正向作用。且流動相種類較多，選擇余

地廣，改變流動相極性和pH值也對分離起到

調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例的兩種或兩種以

上液體作為流動相也可以增大分離選擇性。2．流動相的區(qū)別53．操作條件區(qū)別GC：加溫操作（※對氣相色譜分離效率最有影響的因素）HPLC：室溫；高壓3．操作條件區(qū)別6三、高效液相色譜法的特點(diǎn)

1

．分離效能高2．選擇性高3．檢測靈敏度高4．分析速度快三、高效液相色譜法的特點(diǎn)

1．分離效能高7（二）高效液相色譜法的分類及分離機(jī)制

※按固定相的聚集狀態(tài)分類：

液液色譜法、液固色譜法

按分離機(jī)制分類：

分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法及親合色譜法（二）高效液相色譜法的分類及分離機(jī)制※按固定相的聚集狀態(tài)分8

按流動相與固定相極性的相對強(qiáng)弱分類：

正相色譜法、反相色譜法按流動相與固定相極性的相對強(qiáng)弱分類：9一、※液固吸附色譜法（LSC）

流動相為液體，固定相為固體吸附劑分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱一、※液固吸附色譜法（LSC）

流動相為液體，固定相為固體吸10二、※液液分配色譜法（LLC）

分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異※正相色譜—固定相極性>流動相極性極性小的組分先出柱，極性大的組分后柱，適用于分離溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)，用于含有不同官能團(tuán)物質(zhì)的分離。二、※液液分配色譜法（LLC）

分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶11※反相色譜——固定相極性<流動相極性極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱用于分離非極性至中等極性的分子型化合物。通常對于親水固定液采用疏水性流動相※反相色譜——固定相極性<流動相極性12三、離子交換色譜法（IEC）

※分離機(jī)制：利用組分與固定相表面離子的交換能力的差別（與流動相的性質(zhì)無關(guān)）離子交換色譜與紫外－可見檢測器適用于檢測可離解化合物離子交換色譜與電導(dǎo)檢測器結(jié)合適用于檢測無機(jī)離子——離子色譜法（IC）三、離子交換色譜法（IEC）

※分離機(jī)制：利用組分與固定相表13四、空間排斥色譜法（SEC）分離機(jī)制：利用組分的分子尺寸與凝膠固定相孔徑間的滲透系數(shù)的差別按流動相的性質(zhì)不同：流動相為有機(jī)溶劑——凝膠滲透色譜流動相為水溶液——凝膠過濾色譜主要用于分離生物大分子組分四、空間排斥色譜法（SEC）分離機(jī)制：利用組分的分子尺寸與凝14五、親合色譜法（AC）分離機(jī)制：利用組分與固定相表面上配基的專屬性親和作用的差別固定相——具有生物活性的配基鍵合到載體表面上形成適用于生物樣品中酶、抗體、受體等的分離五、親合色譜法（AC）分離機(jī)制：利用組分與固定相表面上配基的15六、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）分離機(jī)制：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，使組分在吸附－分配的過程中分離應(yīng)用較廣泛的色譜法：反相鍵合相色譜固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（ODS柱）流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動相極性>固定相極性六、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）分離機(jī)制：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液16按分離過程物理化學(xué)原理分類的各種液相色譜法的比較

吸附色譜分配色譜離子色譜空間排阻色譜親和色譜固定相

全多孔固體吸附劑

固定液載帶在固相基體上

高效微粒離子交換劑

具有不同孔徑的多孔性凝膠

多種不同性能的配位體鍵聯(lián)在固相基體上

流動相

不同極性有機(jī)溶劑

不同極性有機(jī)溶劑和水

不同pH值的緩沖溶液

有機(jī)溶劑或一定pH值的緩沖溶液

不同pH值的緩沖溶液，可加入改性劑

分離原理

吸附與解吸

溶解與揮發(fā)

可逆性的離子交換

多孔凝膠的滲透或過濾

具有鎖匙結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的可逆性離解

按分離過程物理化學(xué)原理分類的各種液相色譜法的比較

吸附色譜分17（四）高效液相色譜法的定性定量分析方法與氣相色譜法的分析方法基本相同定性分析方法：

色譜鑒定法

化學(xué)鑒定法

兩譜聯(lián)用鑒定法定量分析方法：

外標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法

面積歸一化法（要求每一個組分都出峰）（四）高效液相色譜法的定性定量分析方法與氣相色譜法的分析方法18第二節(jié)高效液相色譜儀第二節(jié)高效液相色譜儀19

1．貯液瓶（濾芯，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵、梯洗脫度）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置

20※（一）輸液系統(tǒng)一、儲液裝置：過濾器二、脫氣裝置：脫氣機(jī)流動相脫氣：（1）吹氦脫氣法

（2）加熱回流法

（3）抽真空脫氣法

（4）超聲波脫氣法

（5）在線真空脫氣法※（一）輸液系統(tǒng)21高效液相色譜法原理及其應(yīng)用ppt課件22流動相（淋洗劑、洗脫劑）是影響液相色譜分離的一個非常重要的實(shí)驗(yàn)因素。改變流動相的性質(zhì)和組成將改變?nèi)苜|(zhì)組分的保留值、分離選擇性和柱效。在實(shí)際工作中，流動相的可選擇范圍較大是液相色譜的一個顯著特點(diǎn)。流動相（淋洗劑、洗脫劑）是影響液相色譜分離的一個非常重要的實(shí)23※液相色譜中,

組分的保留值大小決定于組分與流動相和固定相分子間作用力：比如吸附、分配、離子交換、親和力等?！合嗌V中,

組分的保留值大小決定于組分與流動相和固定相分24※（二）高壓輸液泵及梯度洗脫裝置

一、高壓輸液泵的種類

高壓輸液泵可以分為以下兩類：1．恒流泵：可輸出恒定體積流量的流動相。（1）注射式泵（又稱螺桿注射泵）（2）往復(fù)型泵（又稱往復(fù)柱塞泵）※（二）高壓輸液泵及梯度洗脫裝置

一、高壓輸液泵的種類25往復(fù)柱塞泵，柱塞向前運(yùn)動，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運(yùn)動，保證將流動相以穩(wěn)定的速度流過色譜柱的部件。二、高壓輸液泵的原理往復(fù)柱塞泵，柱塞向前運(yùn)動，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動，將262．恒壓泵：恒壓泵又稱氣動放大泵，是輸出恒定壓力的泵。2．恒壓泵：恒壓泵又稱氣動放大泵，是輸出恒定壓力的泵。27高效液相色譜法原理及其應(yīng)用ppt課件28避免使用對不銹鋼有腐蝕性的溶劑。例：硝酸、硫酸、鹽酸、鹵化物，四氯化碳與異丙醇或四氫呋喃的混合物等。過濾——用濾膜過濾或垂熔漏斗過濾脫氣——采用超聲或過濾的方法注意流動相使用前沖洗使用含酸、堿、緩沖液的流動相后，必須用不含鹽的有機(jī)溶劑-水沖洗！避免使用對不銹鋼有腐蝕性的溶劑。過濾——用濾膜過濾或垂熔漏斗29二、高壓輸液泵的基本要求：1.流量范圍寬2.重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度好3.輸出的流動相無脈沖影響4.輸出壓力高且耐壓5.密封性能好6.具備壓力檢測和保護(hù)功能二、高壓輸液泵的基本要求：30三、高壓輸液泵的性能參數(shù)

用于分析型輸液泵的流量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.075%～0.3%流量范圍是0.010～10ml/min流動相流速是1～3ml/min最高工作壓力可達(dá)34.47～41.36MPa(300～500bar,5000～6000psi)三、高壓輸液泵的性能參數(shù)

用于分析型輸液泵的流量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差31四、梯度洗脫裝置※梯度洗脫：又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，梯度性地改變洗脫液的組成。從而可以使一個復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達(dá)到良好的分離目的。四、梯度洗脫裝置※梯度洗脫：又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一32※梯度洗脫的原理：流動相由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動相中各溶劑組成的比例改變流動相的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分可在最短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳分離。※梯度洗脫的原理：33※梯度洗脫的優(yōu)點(diǎn)：1.縮短分析周期；2.提高分離能力；3.峰型得到改善，減少拖尾；4.增加靈敏度。但有時引起基線漂移?！荻认疵摰膬?yōu)點(diǎn)：34※（三）進(jìn)樣裝置一、手動注射進(jìn)樣器二、六通閥進(jìn)樣裝置三、自動進(jìn)樣器

※（三）進(jìn)樣裝置一、手動注射進(jìn)樣器35進(jìn)樣閥的基本要求：1.耐高壓2.進(jìn)樣量準(zhǔn)確3.進(jìn)樣重復(fù)性好4.無流量和壓力波動影響進(jìn)樣閥的基本要求：36進(jìn)樣閥的保護(hù)措施：1.在泵和進(jìn)樣閥之間安裝在線過濾器，防止機(jī)械雜質(zhì)進(jìn)入進(jìn)樣閥。2.以緩沖液作流動相時，定期用水清洗進(jìn)樣閥，尤其是在色譜儀關(guān)機(jī)前。進(jìn)樣閥的保護(hù)措施：37自動進(jìn)樣器的組成部分：1.進(jìn)樣閥2.樣品環(huán)管3.進(jìn)樣針頭4.樣品瓶5.支架自動進(jìn)樣器的組成部分：38※（四）色譜柱色譜柱是液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離的核心部分，試樣中各組分在色譜柱中被分離?！ㄋ模┥V柱色譜柱是液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離的核心部分，試39色譜柱的要求：※柱效高：通過減小填料粒度來提高柱效※選擇性好：可通過改變固定相的種類和流動相的種類來改變色譜柱的選擇性。分析速度快色譜柱的要求：40一、柱材料及規(guī)格1．柱材料：色譜柱由柱管和固定相組成，柱管用不銹鋼制成。HPLC柱的填料材料有硅膠、以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁和有機(jī)聚合物微球等。一、柱材料及規(guī)格412．※柱規(guī)格：粒度通常為3μm、5μm、7μm、10μm，柱長10～30cm，內(nèi)徑2～6mm，以4.6mm的內(nèi)徑最常用。目前以反相鍵合相色譜柱應(yīng)用最多，尤其是C18、C8柱2．※柱規(guī)格：粒度通常為3μm、5μm、7μm、10μm，柱42二、色譜柱的性能評價1.理論塔板數(shù)2.不對稱因子3.保留值的重現(xiàn)性二、色譜柱的性能評價43三、色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)1.加流路過濾器和保護(hù)預(yù)柱2.避免高壓沖擊3.采用適合柱的分離條件：PH、柱溫和流動相4.過濾流動相和樣品5.用強(qiáng)溶劑定期沖洗柱三、色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)441.色譜柱的保養(yǎng)色譜柱使用與保存：所有色譜柱使用緩沖液后必須用柱體積20-30倍的水沖洗色譜柱色譜柱柱體積沖洗體積150×4.6mm

2.5ml50ml200×4.6mm

3.3ml65ml250×4.6mm4.2ml80ml1.色譜柱的保養(yǎng)色譜柱使用與保存：45（1）反相譜柱用后的保存：使用緩沖液或含鹽溶液作為流動相，每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)用20倍柱體積的甲醇/乙腈－水溶液（5%）沖洗，使色譜柱內(nèi)的鹽完全溶解洗脫出，再用高濃度的甲醇/乙腈－水溶液（80%～100%）沖洗，使色譜柱中的強(qiáng)吸附物質(zhì)沖洗出來。（1）反相譜柱用后的保存：使用緩沖液或含鹽溶液作為流動相，每46（2）※反相色譜柱長期保存：反相柱可以儲存于甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于經(jīng)脫水處理的正己烷中，離子交換柱可以貯存于5%甲醇－水的溶液中，并將色譜柱兩端的堵頭擰緊，以免干枯，室溫保存。（2）※反相色譜柱長期保存：473.色譜柱的維修（1）如果柱壓實(shí)然增大，可將色譜柱出、入口端顛倒過來，用10～20倍柱體積的流動相沖洗。（2）如果峰形變壞，表明柱入口柱床可能有塌陷，可用同型號填料和乙醇配成勻漿，將塌陷處填平，壓緊。3.色譜柱的維修（1）如果柱壓實(shí)然增大，可將色譜柱出、入口端482.色譜柱的再生（1）反相色譜柱的再生步驟：甲醇－二氯甲烷－正己烷－二氯甲烷－甲醇（2）正相色譜柱的再生步驟：無苯正己烷－二氯甲烷－異丙醇－二氯甲烷－無苯正己烷2.色譜柱的再生（1）反相色譜柱的再生步驟：甲醇－二氯甲烷－49（3）離子交換柱的再生步驟：用稀酸緩沖液沖洗可使陽離子交換柱再生，用稀堿緩沖液沖洗可使陰離子柱再生。（3）離子交換柱的再生步驟：用稀酸緩沖液沖洗可使陽離子交換柱50※（五）檢測器一、定義檢測器是將色譜洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變成電信號的傳感器，并由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄，根據(jù)所得色譜圖上峰的位置、形狀和大小，進(jìn)行定性、定量分析?！ㄎ澹z測器一、定義51二、分類※通用型：示差折光檢測器（DRID）、安培檢測器（AD）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）※專屬型：紫外檢測器（UVD）、可變紫外可見光檢測器（DAD）、熒光檢測器（FD）二、分類52三、檢測器的性能指標(biāo)（1）噪聲（2）基線漂移（3）靈敏度（4）線性范圍（5）重復(fù)性三、檢測器的性能指標(biāo)53四、紫外檢測器1．固定波長紫外吸收檢測器2．可變波長紫外吸收檢測器3．光二極管陣列檢測器只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，工作原理基于Lambert-Beer定律。四、紫外檢測器54五、可變波長紫外檢測器是目前配置最多的檢測器，可根據(jù)組分的最大吸收波長來設(shè)定檢測波長。五、可變波長紫外檢測器55高效液相色譜儀的使用及維護(hù)使用HPLC級試劑和流動相清潔的儀器、流動相和樣品，如果必要，進(jìn)行過濾保證溶劑的相溶性如果必要，沖洗整個系統(tǒng)，去掉鹽，防止污染在規(guī)定的pH范圍內(nèi)選用流動相對儀器的使用、維護(hù)和保養(yǎng)進(jìn)行記錄高效液相色譜儀的使用及維護(hù)56建立高效液相色譜分析方法的一般步驟通常在確定被分析的樣品以后，要建立一種高效液相色譜分析方法必須解決以下問題：①根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。②選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長）和所選用固定相（粒徑及孔徑）。建立高效液相色譜分析方法的一般步驟通常在確定被分析的樣品以57③選擇適當(dāng)?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動相的組成、流速及洗脫方式。④由獲得的色譜圖進(jìn)行定性分析和定量分析。③選擇適當(dāng)?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動相的組成、流速及洗58第三節(jié)高效液相色譜法應(yīng)用示例鹽酸左氧氟沙星滴眼液（5ml:15mg）含量測定測定方法：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以醋酸銨高氯酸鈉溶液（取醋酸銨4.0g和高氯酸鈉7.0g，加水1300ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)PH值至2.2）—乙腈（85:15）為流動相；檢測波長為294nm。第三節(jié)高效液相色譜法應(yīng)用示例鹽酸左氧氟沙星滴眼液（5ml:59稱取左氧氟沙星對照品、環(huán)丙沙星對照品和雜質(zhì)E對照品各適量，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含左氧氟沙星0.12mg、環(huán)丙沙星和雜質(zhì)E各6μg的混合溶液，取10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，左氧氟沙星峰的保留時間約為15分鐘。左氧氟沙星峰與雜質(zhì)E峰和左氧氟沙星峰與環(huán)丙沙星峰的分離度應(yīng)分別大于2.0與2.5。稱取左氧氟沙星對照品、環(huán)丙沙星對照品和雜質(zhì)E對照品各適量，加60供試品溶液的制備與測定

精密量取本品1.0ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱左氧氟沙星對照品適量，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋成每1ml中約含左氧氟沙星0.12mg的溶液，作為對照品溶液。取供試品溶液與對照品溶液各10ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算出供試品中C18H20FN3O4的含量，即得。本品含鹽酸左氧氟沙星以左氧氟沙星（C18H20FN3O4）