流式細胞術(shù)檢測T細胞亞群

流式細胞術(shù)檢測T細胞亞群組長：杜建呈小組成員：李姚

田呈（講解）羅光珍范成芬錢洪珍目的1234了解流式細胞術(shù)的基本發(fā)展過程掌握流式細胞術(shù)的基本原理及應(yīng)用掌握分選T細胞亞群的原理與方法掌握T細胞亞群分選的意義驗實一1934年Moldavan1首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數(shù)，并用光電記錄裝置計測的設(shè)想，在此之前，人們還習慣于測量靜止的細胞，因為要使單個細胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細胞和細胞團塊的淤阻。1953年Crosland–Taylor根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的研究認識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體動力聚集作用。于是設(shè)計了一個流動室，使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。二，流式細胞術(shù)的發(fā)展史1956年，Coulter

在多年研究的基礎(chǔ)上利用

Coulter

效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter計數(shù)器。其基本原理是：使細胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強度和個數(shù)則可獲得有關(guān)細胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年

Holm等設(shè)計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細胞，再由光電檢測設(shè)備計數(shù)的裝置。1973年

Steinkamp設(shè)計了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標記的細胞，既能分析計數(shù)，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計數(shù)技術(shù)的主要歷程?，F(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)是從組織化學發(fā)源的，其開拓者是Kamentsky。1965年，他在組織化學的基礎(chǔ)上提出了兩個新設(shè)想1）細胞的組分是可以用光光度學來定量測定的，即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細胞組織化學的重要信息。2）細胞的不同組分可以同時進行多參數(shù)測量，從而可以對細胞進行分類。換句話說，對同一細胞可以同時獲得有關(guān)不同組分的多方面的信息，用作鑒別細胞的依據(jù)。流式細胞術(shù)在細胞化學中的應(yīng)用的先驅(qū)者是VanDilla和美國的LosAlamos小組。他們在1967年研制出流液束、照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細胞計的基礎(chǔ)上，首次用熒光Feulgen反應(yīng)對DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細胞周期的各個時相。Gohde和Dittrich接著把這項技術(shù)推向?qū)嵱茫麄冇昧魇郊毎g(shù)測定細胞周期借以研究細胞藥代動力學問題。FCM用于免疫組織化學中的關(guān)鍵是對細胞進行免疫熒光染色，其它和在細胞化學的應(yīng)用并沒有多大差異。流式細胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細胞的分選和計數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。三，流式細胞術(shù)的基本原理及應(yīng)用一）流式細胞術(shù)（FCM）是一種可以對細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)進行快速測量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。1，其基本原理是將懸浮分散的單細胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放入樣品管。2，在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動，流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞細胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交相交點稱為測量區(qū)。3，染色的細胞經(jīng)照射發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被呈900角方向放置的光電倍增管熒光檢測器和前向角放置的光電二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電子信號后，經(jīng)膜/數(shù)轉(zhuǎn)換輸入計算機。4，計算機通過相應(yīng)的軟件儲存，計算，分析這些數(shù)字化信息，就可以得到細胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標。二）三）流式細胞儀的工作原理參數(shù)測量原理：流式細胞儀可以同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號和非熒光散射信號。樣品分選原理：流式細胞儀的分選功能是由細胞分選器來完成的。數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（histogram)，二維點圖（dotplot），二維高等圖（contour），假三維圖（pseudo3D）和列表模式（listmode）等。四，T細胞亞群的檢測1，實驗內(nèi)容：流式細胞術(shù)檢測CD4+，CD8+T細胞。2，實驗原理（1）：T淋巴細胞具有高度的異質(zhì)性，根據(jù)其表面的標志和功能特征，可分為若干個亞群，各亞群之間相互調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮其免疫學功能。因此，對淋巴細胞亞群數(shù)量的檢測能反映機體的免疫功能狀態(tài)。本次實驗用流式細胞術(shù)檢測CD4+,CD8+T細胞。（流式細胞術(shù)原理見前面流式細胞術(shù)的基本原理及應(yīng)用）實驗原理（2）T淋巴細胞表面的CD分子與相應(yīng)熒光素直接標記的抗人CD