第七章-色譜分析法導(dǎo)論課件

第一節(jié)

概論

一、色譜分析法應(yīng)用二、色譜法與色譜分析方法三、色譜分析法的特點第一節(jié)概論一、色譜分析法應(yīng)用二、色譜法與色譜分析方法三、1一、色譜分析法應(yīng)用

1.定量分析主要分析有機(jī)物，也可分析部分無機(jī)物。GC：分析沸點500℃以下，熱穩(wěn)定性好，分子量400以下的物質(zhì)，約占有機(jī)物總量的15～20%。LC：分析沸點高，熱穩(wěn)定性差，大分子量的物質(zhì)，約占有機(jī)物總量的75～80%。

GC與LC相結(jié)合，相互補充，可以分析絕大多數(shù)常見的有機(jī)化合物。檢測限：ppm～ppb與所用檢測器的種類和性能有關(guān)。一、色譜分析法應(yīng)用1.定量分析GC：分析沸點500℃以下，22.簡單定性回答“是不是”2.簡單定性3二、色譜法與色譜分析方法

1.色譜法是一種物理化學(xué)的分離方法創(chuàng)造人：俄國植物學(xué)家茨維特（M.Tswett）1905年，分離植物色素的試驗。分離后，在玻璃管內(nèi)呈現(xiàn)出不同顏色帶，色譜一詞由此得名。后來，也用來分離無色物質(zhì)，習(xí)慣上仍稱為色譜法。植物色素碳酸鈣石油醚二、色譜法與色譜分析方法1.色譜法植物色素碳酸鈣石油4色譜發(fā)展史

最早創(chuàng)立色譜法的是俄國植物學(xué)家Tswett。他在研究植物葉子的色素成分時，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。當(dāng)時Tswett把這種色帶叫做“色譜”（Chromatographie，Tswett于1906年發(fā)表在德國植物學(xué)雜志上用此名，英譯名為Chromatogra-phy），在這一方法中把玻璃管叫作“色譜柱”，碳酸鈣叫作“固定相”，純凈的石油醚叫作“流動相”。

在Tswett提出色譜概念后的20多年里沒有人關(guān)注這一偉大的發(fā)明。直到1931年德國的Kuhn和Lederer才重復(fù)了Tswett的某些實驗，用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-，β-，和γ-胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60多種這類色素。第七章-色譜分析法導(dǎo)論ppt課件5Martin和Synge在1940年提出液液分配色譜法（Liquid－LiquidPartitionChromatography），即固定相是吸附在硅膠上的水，流動相是某種有機(jī)溶劑。1941年Martin和Syngee提出用氣體代替液體作流動相的可能性，11年之后James和Martin發(fā)表了從理論到實踐比較完整的氣液色譜方法（Gas－LiquidChromatography），因而獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎。在此基礎(chǔ)上，1957年Golay開創(chuàng)了開管柱氣相色譜法（Open－TubularColumnChromatography），習(xí)慣上稱為毛細(xì)管柱氣相色譜法（CapillaryColumnChromatography）。1956年VanDeemter等在前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)展了描述色譜過程的速率理論，1965年Giddings總結(jié)和擴(kuò)展了前人的色譜理論，為色譜的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。Martin和Synge在1940年提出液液分配色譜法（L6另一方面早在1944年Consden等就發(fā)展了紙色譜，1949年Macllean等在氧化鋁中加入淀粉粘合劑制作薄層板使薄層色譜法（TLC）得以實際應(yīng)用，而在1956年Stahl開發(fā)出薄層色譜板涂布器之后，才使TLC得到廣泛地應(yīng)用。在60年代末把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜，出現(xiàn)了高效液相色譜（HPLC）。80年代初毛細(xì)管超臨界流體色譜（SFC）得到發(fā)展，但在90年代后未得到較廣泛的應(yīng)用。而在80年代初由Jorgenson等集前人經(jīng)驗而發(fā)展起來的毛細(xì)管電泳”（CZE），在90年代得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。同時集HPLC和CZE優(yōu)點的毛細(xì)管電泳色譜在90年代后期受到重視。到21世紀(jì)色譜科學(xué)將在生命科學(xué)等前沿科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮不可代替的重要作用。另一方面早在1944年Consden等就發(fā)展了紙色譜，1947在色譜分離裝置中，流動的那一相稱為流動相，固定不動的那一相稱為固定相。

色譜法：是利用混合物各組分在固定相和流動相中具有不同分配系數(shù)（或吸附系數(shù)、滲透能力等），當(dāng)兩相作相對運動時，這些物質(zhì)在兩相中進(jìn)行多次反復(fù)分配而實現(xiàn)分離。

植物色素碳酸鈣石油醚在色譜分離裝置中，流動的那一相稱為流82.色譜法分類

有三種分類方法

⑴按兩相狀態(tài)分類

流動相固定相

液固色譜LSC液液色譜LLC氣固色譜GSC氣液色譜GLC液相色譜LC氣相色譜GC（液體涂在擔(dān)體表面）超臨界色譜:以超臨界狀態(tài)下的CO2作流動相。接近液體的溶解性和氣體的流動性，兼有液相、氣相色譜的優(yōu)點。2.色譜法分類有三種分類方法⑴按兩相狀態(tài)分類流動相固9⑵按固定相的固定方式分類

柱色譜：固定相裝在色譜柱或涂布在柱壁上?！疤畛渲薄懊?xì)管柱”紙色譜：以濾紙上的纖維及其結(jié)合水作固定相。薄層色譜：將吸附劑涂布在平板上作固定相。平板色譜

⑵按固定相的固定方式分類柱色譜：固定相裝在色譜柱或涂布在柱10

吸附色譜：利用固定相表面吸附力的差異分離混合物。(物理吸附，可解吸附；硅膠、氧化鋁、活性炭等)分配色譜：利用不同組分在兩相間分配系數(shù)的差異分離混合物（兩相對被分離組分溶解度的差異，將水吸附在固相硅膠上，以氯仿沖洗，成功分離了氨基酸，這就是現(xiàn)在常用的分配色譜）。排阻色譜：利用多孔物質(zhì)對不同大小或形狀的分子阻力上的差異分離混合物。（大孔吸附樹脂為吸附性和篩選性原理相結(jié)合的分離材料。）

⑶按分離機(jī)理分類

吸附色譜：利用固定相表面吸附力的差異分離混合物。(物理吸附11

離子交換色譜：利用離子交換原理分離混合物。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法進(jìn)行分離。離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異來實現(xiàn)分離。離子交換色譜的固定相一般為離子交換樹脂，樹脂分子結(jié)構(gòu)中存在許多可以電離的活性中心，待分離組分中的離子會與這些活性中心發(fā)生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。

離子交換色譜：利用離子交換原理分離混合物。123、色譜分析法

將色譜分離方法與適當(dāng)?shù)臋z測手段相結(jié)合，用于化學(xué)物質(zhì)分析的方法。是一種儀器分析方法。⑴方法分類

氣相色譜法，液相色譜法（均屬柱色譜）⑵儀器分類氣相色譜儀，液相色譜儀3、色譜分析法將色譜分離方法與適當(dāng)?shù)臋z13三、色譜分析法的特點：

1.分離效能高（最突出的優(yōu)點）一般的分離手段（萃取、蒸餾等）與之無法相比。例：GC可將石油中的二百多個組分一次全部分開，LC可將食品中的氨基酸（可多達(dá)20多種）一次分開。2.靈敏度高檢測限可以達(dá)到ppm～ppb，與之配備高靈敏度的檢測器有關(guān)。常見檢測器有：熱導(dǎo)池、氫焰檢測器、電子捕獲器等等。三、色譜分析法的特點：1.分離效能高（最突出的優(yōu)點）143.所需樣品量很?。▁xμL）

在疾病診斷、病人抽血、刑事偵察方面有較大意義。4.分析速度快

一次色譜分析一般只需要幾分鐘～幾十分鐘，最快只需幾秒鐘，與高效率的分離和計算機(jī)的應(yīng)用有直接關(guān)系。5.應(yīng)用范圍廣

GC與LC相結(jié)合，幾乎可以分析全部的常見有機(jī)物。

3.所需樣品量很?。▁xμL）15第二節(jié)

色譜圖及相關(guān)術(shù)語一、色譜過程示意圖A+B沖洗劑色譜柱檢測器記錄儀BABABA第二節(jié)色譜圖及相關(guān)術(shù)語一、色譜過程示意圖A+B沖洗劑色譜柱16A+BABABBAABBA檢測器記錄儀載氣A+BABABBAABBA檢測器記錄儀載氣17流動相流出曲線組份的縱向擴(kuò)散流動相流出曲線組份的縱向擴(kuò)散18二、色譜圖

試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后依次進(jìn)入檢測器，由記錄儀記錄的電信號強度—時間曲線，稱為色譜圖，也叫做流出曲線。

下圖是一個典型的氣相色譜圖。

進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’二、色譜圖試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后19第七章-色譜分析法導(dǎo)論ppt課件201.基線沒有組分進(jìn)入檢測器時，系統(tǒng)噪聲隨時間變化的線稱為基線。穩(wěn)定的基線是一條直線。2.色譜峰組分的響應(yīng)信號隨時間變化而形成的峰形曲線。正常情況下，每一種組份對應(yīng)一個峰，且色譜峰呈對稱性。3.峰高（h）峰頂點到基線的距離。進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’1.基線進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’21４.峰底寬度（Ｗb）峰拐點切線與基線延長線相交的截距。５.半峰寬（Ｗ１／２）峰高一半處的峰寬度。６.峰面積（Ａ）峰與基線延長線所包圍的面積。進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’４.峰底寬度（Ｗb）進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/222三、保留值

保留值是表示樣品中各組份在色譜柱中滯留時間的數(shù)值。在固定的試驗條件下，每一種組份都有固定的保留值。是色譜定性的依據(jù)。

保留值包括以下幾種：

1.保留時間（tR）從進(jìn)樣開始到色譜峰最大值出現(xiàn)所用的時間。（出現(xiàn)濃度最大值所用時間）。即某一組份通過色譜柱所需的時間。進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’三、保留值保留值是表示樣品中各組份232.死時間（t。）不被固定相保留的組份（如GC中的空氣）通過色譜柱所需的時間。實際上就是流動相流經(jīng)色譜柱所需的時間。

t。=L/ū

（式中L：柱長ū：流動相平均線速度)3.調(diào)整保留時間（tR’）某一組份在固定相中停留時間的總和。

tR’=tR－t0（即：

tR=t0+tR’

）進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’2.死時間（t。）進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h24四、相對保留值與選擇性相對保留值：某組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比。評價兩組分分離效果的指標(biāo)進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’四、相對保留值與選擇性相對保留值：某組份2的調(diào)整保留值與組份25

tR2’

：為后出峰組份的調(diào)整保留時間。α總大于1。

α↑，說明兩峰相距越遠(yuǎn)，即兩組份的分離效果越好，即方法的選擇性越好。是對分離方法的評價指標(biāo)。選擇性：兩個相鄰組份（通常選擇最難分離的物質(zhì)對）的相對保留值。tR2’：為后出峰組份的調(diào)整保留時間。α總大于126第三節(jié)

定性和定量分析

一、定性分析

依據(jù)：在一定的條件下，每種物質(zhì)都有自己固定的保留值。方法：1.與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較保留值

2.在樣品中加入適量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，峰高增加而半峰寬不變的色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為同一化合物。第三節(jié)定性和定量分析一、定性分析依據(jù)：在一定的條件下，27二、定量分析

依據(jù)：被測組份的重量（或濃度）與檢測器的響應(yīng)信號成正比。

Wi：組分i的質(zhì)量（或濃度）

Ai

：組分i的峰面積（即響應(yīng)信號）

fi

：組分i的校正因子二、定量分析依據(jù)：被測組份的重量（或濃度）與檢測器的響應(yīng)信28㈠峰面積的測量1.峰高乘半峰寬法（適用于對稱峰，不適用于不對稱峰或很窄的縫）。

A=1.065hw?2.峰高乘平均峰寬法（適用于不對稱峰）

A=h（w0.15+w0.85）3.用峰高表示峰面積（適用于痕量分析中的對稱峰）4.自動積分儀法（適用于任何峰）

進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’㈠峰面積的測量進(jìn)樣空氣峰電信號t0tRtRwbw1/2h’29㈡校正因子

色譜定量分析中，被測物質(zhì)的量與其峰面積成正比，并且有一個相互換算關(guān)系，這個換算關(guān)系就是校正因子。1.絕對校正因子

fi與操作條件有關(guān)，不穩(wěn)定，在實際應(yīng)用時，采用相對校正因子。㈡校正因子色譜定量分析中，被測物質(zhì)的量302.相對校正因子

fi/s的測定方法：準(zhǔn)確稱量一定量的被測物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，混合后進(jìn)樣，分別測出它們的峰面積，按上式計算fi/s

。fi/s與分析條件無關(guān)，僅僅與被測物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及檢測器類型有關(guān)。所以，fi/s是一個穩(wěn)定的值。2.相對校正因子

fi/s的測定方法：準(zhǔn)確稱量一定量的31㈢定量分析方法

1.歸一化法原理：將樣品中所有組分之和按100%計。㈢定量分析方法1.歸一化法32優(yōu)點：①簡便，不用稱量；②準(zhǔn)確，操作條件對結(jié)果影響不大；③當(dāng)組份的fi/s相近時，可不必求fi/s而直接將面積歸一化。缺點：①所有組份都要有峰；②只對個別組份定量時，比較繁瑣。優(yōu)點：①簡便，不用稱量；332.外標(biāo)法（工作直線法）

優(yōu)點：①不必求fi/s；②處理批量樣品時更快捷。缺點：①對進(jìn)樣準(zhǔn)確性要求高；②整個過程中，操作條件要十分穩(wěn)定（與不使用fi/s有關(guān)）。C濃度

A（峰面積）A2.外標(biāo)法（工作直線法）優(yōu)點：①不必求fi/s；C濃度343.內(nèi)標(biāo)法

向待測樣品中加入一內(nèi)標(biāo)物ws。3.內(nèi)標(biāo)法向待測樣品中加入一內(nèi)標(biāo)物ws。35優(yōu)點：①因為Ws/W比值比較穩(wěn)定，所以進(jìn)樣準(zhǔn)確性要求不高；②由于通過Ai/As比值來計算，操作條件稍有變化對測量結(jié)果沒有影響。缺點：①每次分析都需要準(zhǔn)確稱量試樣和內(nèi)標(biāo)物；②必須測定校正因子。優(yōu)