熏肉制品中亞硝酸鹽含量的測定實驗報告

熏肉制品中亞硝酸鹽含量的測定華南師范大學(xué)09化一摘要：肉制品是一類深受人民群眾喜愛的食品，在其生產(chǎn)過程中多采用亞硝酸鹽作為發(fā)色劑，它不僅能使肉制品保持良好的色澤，還能抑制肉毒梭狀芽孢桿菌，保證肉制品的后熟風(fēng)味。但近年來由于亞硝酸鹽攝入量過多引起的食物時中毒時有發(fā)生，且加硝處理過的肉制品中的亞硝酸鹽可與胺類生成強致癌物亞硝胺，對人體健康產(chǎn)生潛在的危害。本實驗用紫外分光光度法測定熏肉制品中亞硝酸鹽的含量。關(guān)鍵字：熏肉制品亞硝酸鹽紫外分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線法鹽酸-萘乙胺引言鹽的性質(zhì):亞硝酸和硝酸的鈉鹽和鉀鹽常被加入用于腌肉的混合物中，用來產(chǎn)生和保持色澤、抑制微生物和產(chǎn)生特殊的風(fēng)味。此外，亞硝酸鹽(150-200mg/kg)可抑制罐裝碎肉和腌肉中的梭狀芽抱桿菌。亞硝酸鹽的抗微生物作用為它使用于可能生成長肉毒梭狀芽孢桿菌的腌肉中提供了正當(dāng)?shù)睦碛?。亞硝酸鹽含量只要控制在安全范圍內(nèi)使用不會對人體造成危害。肉制品中，亞硝酸鹽含量不得超過30mg/kg，這是因為亞硝酸鹽的中毒劑量是200毫克以上，而正常膳食中的亞硝酸鹽即使是大量用亞硝酸鹽做食品添加劑的肉類，也不會超過50毫克。中毒后癥狀：亞硝酸鹽是不會蓄積在體內(nèi)的，膳食中絕大部分亞硝酸鹽隨尿排出，不會對人體造成危害。過量亞硝酸鹽進入人體，會氧化血液中的血紅蛋白為高鐵血紅蛋白，后者無攜氧功能，導(dǎo)致組織缺氧，引起腸原性青紫癥，皮膚青紫是本病的特征，尤以口唇青紫最為普遍。口服亞硝酸鹽10分鐘至3小時后，

可出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐等癥狀。嚴(yán)重者出現(xiàn)意識喪失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡。亞硝酸鹽作用機理HCIIH2CHOOC(CHNN■NNH3cHCIIH2CHOOC(CHNN■NNH3cCH3CH3H2NNH22)N(CH2)2COOHCh3H20(O2)—CH2當(dāng)血紅蛋白中的鐵處于+2(亞鐵)并且缺乏配體鍵合所需的第6部位時，它被稱為肌紅蛋白，是由珠蛋白和血紅素組成的絡(luò)合物，位居血紅蛋白中央的鐵原子(d2sp3)具有6個配位部位，其中4個分別被圖吡咯環(huán)蛋白結(jié)構(gòu)圖占據(jù)，第5個配位部位與珠蛋白的組氨酸殘基鍵合，剩余的第6個配位部位可與各種配基提供的電負性原子絡(luò)合。亞硝酸鹽為強氧化劑，進人人體后，可使血中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去運氧的功能，導(dǎo)致組織缺氧。亞硝酸鹽在肉中形成一氧化一氮，而一氧化一氮與血紅素類化合物作用生成亞硝酰肌紅蛋白，這種色素產(chǎn)生了腌肉的紅色。目前我國測定的食品中亞硝酸鹽含量的方法有：離子色譜法，分光光度法，氣相吸收光譜法，示波極譜法，格里斯試劑比色法。離子色譜法的原理：試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)，出去脂肪后，采用相反的方法提取和凈化，以氫氧化鉀溶液為淋洗液，陰離子交換柱分離，電導(dǎo)檢測器檢測，以保留時間定性外標(biāo)法定量。分光光度法法原理：試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)，出去脂肪后在弱酸條件下，亞硝酸

鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標(biāo)法測定亞硝酸鹽含量。氣象吸收光譜法原理：在0.15-0.3mol/L檸檬酸介質(zhì)中加入，將亞硝酸鹽瞬間轉(zhuǎn)化成N02。用空氣載入氣相分子吸收光譜儀的吸光光譜中，在213.9mm等波長處測得的吸光度與水樣中亞硝酸鹽濃度遵守比爾定律，以此計算出亞硝酸鹽的含量。現(xiàn)實生活中，食品檢測人員經(jīng)常采用亞硝酸鹽快速測試盒測定食品中亞硝酸鹽的含量，亞硝酸鹽快速測試盒采用N-1-萘乙二胺代替?zhèn)鹘y(tǒng)的a-萘胺，使顯色的靈敏度高，顯色的摩爾質(zhì)量增大，測定出來的結(jié)果更準(zhǔn)確，但鑒于各方面的局限性，本實驗我們采用紫外分光光度法，以a-萘胺為顯色劑測定熏肉制品中亞硝酸鹽的含量。其實驗原理如下：實驗原理：自樣品中抽提分離出亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在酸性條件下與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽，此重氮鹽再與a-萘胺試劑發(fā)生偶合反應(yīng)，生成紫紅色偶氮化合物。其顏色的深度與樣液中亞硝酸含量成正比，可比色測定。反應(yīng)式如下：NO2-+H++H2NN三NO2-+H++H2NN三NNSO3h+SO3HNH2SO3H H2OSO3H NH2肉制品中亞硝酸鹽含量==肉制品中亞硝酸鹽含量==mg/kg)40 1mxx-50050式中：X為由測得的吸光度什在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的亞硝酸鈉質(zhì)量濃度(pg/mL)；m為樣品質(zhì)量(g)。主要試劑及儀器所有加入的量都要準(zhǔn)確加入2)(1)亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6克亞鐵氰化鉀［K4Fe(CN)6?3H2O］溶于水，并稀釋至100mL2)乙酸鋅溶液：稱取22.0克乙酸鋅［Zn(CH3COO)2?2H2O］，加3mL冰醋酸溶于水，并稀釋至100mL。(3)飽和硼砂溶液：5.0克硼酸鈉(Na2BO4?10H2O)溶于100mL熱水中，冷卻備用。(4)0.4%對氨基苯磺酸溶液4g/L)。稱取0.4g對氨基苯磺酸，溶于100mL20%鹽酸中，置棕色瓶中，混勻，避光保存。(5)0.2%鹽酸萘乙二胺溶液(2g心。稱取0.1g鹽酸奈乙二胺固體溶于去離子水，定容至50mL。(6)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(200pg/mL):精確稱取0.1000克于硅膠干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉(優(yōu)級純)，加水定容到500mL。(7)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(5pg/mL)：臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00mL,置于200mL的容量瓶中，加水稀釋到刻度。(8)儀器：①研缽，②分光光度計，③分析天平，④2mL、5mL、10mL移液管各2支，⑤100mL容量瓶3個⑥200mL容量瓶1個，⑦500mL容量瓶1個，⑧50mL容量瓶10支，⑨濾紙，⑩100燒杯，玻璃棒實驗操作樣品處理樣品中硝酸鹽及亞硝酸鹽的提?。悍Q取經(jīng)攪拌混合均勻的樣品5克于50mL燒杯中，加入硼砂飽和溶液12.5mL，以玻璃棒攪拌，然后用70工左右的重蒸餾水約300mL,將其稀釋轉(zhuǎn)移到500mL容量瓶，(燒杯)沸水浴中加熱15分鐘，取出，一邊轉(zhuǎn)動一邊加入5mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加5mL乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質(zhì)。冷卻到室溫，用蒸餾水定容，搖勻。放置片刻，去除上層脂肪，清液用濾紙過濾。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用移液管精確吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液(5pg/mL)0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5,2.0,2.5mL(各含0,1,3,4,5,7.5,10,12.5pg亞硝酸鈉)于一組50mL容量瓶中，各加水至25mL,分別加2mL0.4%對氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置3—5min后，各加入1mL0.2%a-萘胺溶液，并用水定容到50mL,搖勻。靜置15min后(時間取吸光度最大的顯色時間)用20mm比色皿，用分光光度計在540nm波長(選擇吸光度最大的吸收波長)下測定吸光度，以蒸餾水為空白。以測得的各比色液的吸光度對應(yīng)的亞硝酸濃度作曲線。比色液中亞硝酸鈉濃度為0~0.30pg/mL時，兩者呈線性關(guān)系。本法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為±3.0%。亞硝酸鹽的測定取20mL待測液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%對氨基苯磺酸溶液，搖勻。靜置3~5分鐘后，加入0.5mL02%a-萘胺溶液，比色測定，記錄吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算得相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度（pg/mL），計算試樣中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的含量。結(jié)果與討論最大吸收波長的選擇以蒸餾水為背景溶液，用0.08pg/mL的亞硝酸鈉溶液在波長450-600的不同吸光度如下表：波長450460470480490500510520吸光度0.0070.0090.0130.0170.0230.0290.0410.050波長530540545550560570580590吸光度0.0570.0610.0600.0590.0580.0490.0380.024吸光度由以上的圖表可看出在吸收波長為450-540，溶液的吸光度不斷增大，吸收波長為540-590，溶液的吸光度不斷減少。所以，540處為溶液的最大吸收波長。最優(yōu)顯色時間的選擇以蒸餾水為背景溶液，濃度為0.08pg/mL的亞硝酸鈉鹽溶液，加入1mL的顯色劑，在顯色時間分別為Omin，5min，10min,15min,20min時測定它們的吸光度，結(jié)果如下表：顯色時間0min5min10min15min20min吸光度0.0580.0640.0650.0640.064由上表可以看出，溶液的吸光度受時間的影響不大，顯色時間為15min時，溶液的吸光度最大，所以10min為最佳顯色時間。最佳顯色用量的選擇以蒸餾水為背景溶液以濃度為O.O8Pg/mL的亞硝酸鈉鹽溶液分別加入0.5mL,ImL,1.5mL,2mL,2.5mL,3.0mL的顯色劑用量，顯色時間為15min時分別測定它們的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，如下表;顯色劑用量0.5mL1.0mL1.5mL2.0mL2.5mL3.0mL吸光度0.0580.0640.0650.0610.0630.063由上表可以看出，溶液的吸光度受顯色劑的用量的影響是有波動的，規(guī)律不是很明顯，但不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)顯色劑用量為1.5mL時，吸光度最大，所以顯色劑的用量為1.5mL為最佳用量。最佳背景溶液的選擇分別以①去離子水，②對氨基苯磺酸溶液，③對氨基苯磺酸加氯化鈉溶液和④對氨基苯磺酸加顯色劑溶液為背景溶液測定濃度為0.010pg/mL的亞硝酸鈉鹽溶液的吸光度。

背景溶液吸光度①去離子水0.076②對氨基苯磺酸溶液0.076③對氨基苯磺酸加氯化鈉溶液0.067④對氨基苯磺酸加顯色劑溶液0.067由上表看出，以去離子水或?qū)Π被交撬崛芤簽楸尘叭芤?，它們的吸光度都最大，?.076，但去離子水簡單，因此實驗時我們選擇去離子水為背景溶液。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制由前面的四個步驟探索出來的四個條件為標(biāo)準(zhǔn)，分別向不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入1.5mL顯色劑，顯色時間為10min，以去離子水為背景溶液，在吸收波長為540nm處，測定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：濃度0.000.020.040.060.080.100.150.20吸光度0.0070.0230.0430.0500.0610.0760.1170.1516.樣品溶液的吸光度的測定：樣品溶液的吸光度：0.026把數(shù)據(jù)代入亞硝酸鈉鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.7102x+0.0088得：x=0.0242Xx-^x1000肉制品中亞硝酸鹽含量== 1000 （mg/kg）40 1mxx-50050式中：X為由測得的吸