大學(xué)課程干細(xì)胞與組織工程課件

第七章.干細(xì)胞與組織工程StemCell&TissueEngineering第七章.干細(xì)胞與組織工程StemCell&Tissu1有關(guān)干細(xì)胞領(lǐng)域的研究成果多次獲得世界十大科技進(jìn)展2006年干細(xì)胞培育器官獲重要進(jìn)展

2007年人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）誕生

2008年美、英干細(xì)胞研究獲一系列新進(jìn)展

2009年無病毒轉(zhuǎn)染獲得iPS細(xì)胞

2012年癌癥干細(xì)胞研究獲新證據(jù)；日本科學(xué)家首次用“人造”卵子產(chǎn)下小鼠；德國首次從皮膚細(xì)胞中培養(yǎng)出成體干細(xì)胞

2013年人類克隆來源的胚胎干細(xì)胞有關(guān)干細(xì)胞領(lǐng)域的研究成果多次獲得世界十大科技進(jìn)展2006年干2Definingthemodeoftumourgrowthbyclonalanalysis.Nature,2012Arestrictedcellpopulationpropagatesglioblastomagrowthafterchemotherapy.Nature,2012LineageTracingRevealsLgr5+

StemCellActivityinMouseIntestinalAdenomas.Science,2012癌癥干細(xì)胞驅(qū)動腫瘤的發(fā)生，并逃避放化療引起復(fù)發(fā)Definingthemodeoftumourgr3OffspringfromOocytesDerivedfrominVitroPrimordialGermCell–LikeCellsinMice.Science,2012OffspringfromOocytesDerived4干細(xì)胞（stemcell）是具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，可以分化產(chǎn)生一種以上的“專業(yè)”細(xì)胞。干細(xì)胞基本特性：self-renewal;differentiation干細(xì)胞按來源的分類：

胚胎干細(xì)胞（含iPS）

成體干細(xì)胞（含腫瘤干細(xì)胞）干細(xì)胞按分化潛能的分類：

全能干細(xì)胞（totipotentstemcell）

多能干細(xì)胞（pluripotentstemcell）

專能/定向干細(xì)胞（unipotent/committedstemcell）干細(xì)胞（stemcell）是具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，5干細(xì)胞的自我更新干細(xì)胞的對稱分裂symmetrydivision不對稱分裂a(bǔ)symmetrydivision干細(xì)胞的自我更新干細(xì)胞的對稱分裂symmetrydivis6造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞7骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞8存在于小腸上皮組織基底層的單能干細(xì)胞存在于小腸上皮組織基底層的單能干細(xì)胞9干細(xì)胞研究的意義臨床疾病的細(xì)胞移植療法結(jié)合組織工程技術(shù)構(gòu)建人工器官用于器官移植為早期胚胎發(fā)育機(jī)制研究提供模型為研究發(fā)育相關(guān)基因的功能提供模型提供更便捷的轉(zhuǎn)基因動物方案發(fā)現(xiàn)新基因和基因功能分析新藥開發(fā)、藥效與藥物毒性評估的細(xì)胞模型干細(xì)胞研究的意義臨床疾病的細(xì)胞移植療法10干細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷史20世紀(jì)初認(rèn)識到干細(xì)胞是組織細(xì)胞自我更新的起源1961年發(fā)現(xiàn)骨髓移植治療白血病的秘密在于骨髓中存在造血干細(xì)胞1964年P(guān)ierce等發(fā)現(xiàn)取自小鼠畸胎瘤的細(xì)胞具有多能性1970年Evans從小鼠胚胎中分離并體外培養(yǎng)了胚胎干細(xì)胞1981年Evans首次成功建立了小鼠ES細(xì)胞系1998年Thomson成功建立了人ES細(xì)胞系，點(diǎn)燃了干細(xì)胞研究的熱情，也引起了廣泛的倫理爭議1998-99年多種干細(xì)胞的跨譜系分化或轉(zhuǎn)分化的突破證明了干細(xì)胞的可塑性2000年底英國通過了克隆人類早期胚胎用于分離ES細(xì)胞進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究的決議，并率先建立人類干細(xì)胞庫；日本這年啟動的“千年世紀(jì)工程”中，干細(xì)胞作為四大重點(diǎn)之一干細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷史20世紀(jì)初認(rèn)識到干細(xì)胞是組織細(xì)胞自我更112007年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予美國科學(xué)家馬里奧-卡佩奇和奧利弗-史密西斯、英國科學(xué)家馬丁-埃文斯，以表彰他們在涉及胚胎干細(xì)胞和哺乳動物DNA重組方面的一系列突破性發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)現(xiàn)使“基因打靶”技術(shù)成為可能。MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies2007年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予美國科學(xué)家馬里奧-卡佩奇12第一節(jié).胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ESC）是指主要來自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能性干細(xì)胞，具有分化為三胚層所有細(xì)胞的能力。第一節(jié).胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞（embryonicstem13

形態(tài)特征：細(xì)胞呈集落生長，集落邊緣光滑清晰，細(xì)胞間緊密堆積，無明顯細(xì)胞界限，細(xì)胞體積小，核質(zhì)比大，具有正常二倍體核型。生化特征：表達(dá)SSEA、OCT-4、AKP等，端粒酶活性高一、ESC的生物學(xué)特性形態(tài)特征：一、ESC的生物學(xué)特性14ES細(xì)胞的多能性ESC具有分化為三胚層來源的各種類型細(xì)胞的潛能自發(fā)分化：維持未分化狀態(tài)的條件不存在時，自發(fā)分化為各種類型細(xì)胞；定向誘導(dǎo)分化：在不同的誘導(dǎo)條件下，可定向分化為特定類型的細(xì)胞。ES細(xì)胞的自我更新能在體外無限增殖，且保持正常的核型和未分化狀態(tài)ES細(xì)胞的多能性15大學(xué)課程干細(xì)胞與組織工程課件16ES細(xì)胞分化的調(diào)控內(nèi)源性調(diào)控：細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白對分裂的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控（如OCT4，NANOG，SOX2等）外源性調(diào)控：間質(zhì)細(xì)胞分泌的因子（如TGFβ家族，Wnt/β-catenin信號通路）膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用（Notch信號通路）整合素（integrin）與ECMES細(xì)胞分化的調(diào)控17ESC多能性的體現(xiàn)（驗(yàn)證方法）形成畸胎瘤（teratoma）形成類胚體（embryoidbody）直系分化（directdifferentiation）形成嵌合體（chimera）四倍體補(bǔ)償（tetraploidcomplementation）ESC多能性的體現(xiàn)（驗(yàn)證方法）18畸胎瘤實(shí)驗(yàn)ESC注射到裸鼠皮下，形成畸胎瘤，其中三胚層來源的各類組織雜亂聚集。體內(nèi)鑒定ESC多能性的指標(biāo)擬胚體實(shí)驗(yàn)擬胚體是ESC懸浮培養(yǎng)后自發(fā)分化形成的球狀細(xì)胞群，能進(jìn)一步分化為三胚層各類型的細(xì)胞。也常在這階段以不同的誘導(dǎo)物起始定向誘導(dǎo)分化直系分化實(shí)驗(yàn)通過控制ESC生長環(huán)境或遺傳操縱特定基因表達(dá)，可誘導(dǎo)其直接分化為特定種系細(xì)胞畸胎瘤實(shí)驗(yàn)19胚胎嵌合實(shí)驗(yàn)將ESC顯微注射到囊胚腔中，使ESC能整合到宿主囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，嵌合的胚胎移入母體后出生的后代各器官都呈兩類細(xì)胞的嵌合，表明ESC參與嵌合體各器官的發(fā)育，甚至發(fā)生生殖系嵌合。四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)2-細(xì)胞期誘導(dǎo)2個卵裂球融合形成四倍體，繼續(xù)發(fā)育形成的四倍體囊胚沒有ICM，只有滋養(yǎng)層。將ESC顯微注射到這種空囊胚中，移植后出生的后代完全來自ESC。被稱為驗(yàn)證ESC多能性的金標(biāo)。胚胎嵌合實(shí)驗(yàn)20二、ES細(xì)胞的建系培養(yǎng)ES細(xì)胞的來源ICM的分離ESC的培養(yǎng)體系二、ES細(xì)胞的建系培養(yǎng)ES細(xì)胞的來源21ES細(xì)胞的來源通常來自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或早期的卵裂球也包括原生殖細(xì)胞來源的EG細(xì)胞或畸胎瘤來源的EC細(xì)胞ES細(xì)胞的來源22用于ESC建系的囊胚可以來自體內(nèi)/體外受精或核移植用于ESC建系的囊胚可以來自體內(nèi)/體外受精或核移植23囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）的分離選擇高質(zhì)量囊胚：囊胚腔充分?jǐn)U張；滋養(yǎng)層完整，細(xì)胞單層連續(xù)排列；ICM明顯，細(xì)胞數(shù)較多，排列致密。囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）的分離選擇高質(zhì)量囊胚：24囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）的分離透明帶的去除：酸性Tyrode’s液(pH2.5)或鏈霉蛋白酶(pronase，0.5%)分離ICM：機(jī)械分離法免疫外科法組織培養(yǎng)法顯微外科法囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）的分離透明帶的去除：25ES細(xì)胞體外培養(yǎng)的關(guān)鍵是應(yīng)用飼養(yǎng)層細(xì)胞（feedercells）和分化抑制因子（常用LIF）ESC的培養(yǎng)體系ES細(xì)胞體外培養(yǎng)的關(guān)鍵是應(yīng)用飼養(yǎng)層細(xì)胞（feedercel26ESC的培養(yǎng)體系飼養(yǎng)層細(xì)胞（feedercells）指在共培養(yǎng)體系中用于支持ES細(xì)胞生長的成纖維細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素C（終濃度0.01mg/ml）處理2-3h失去分裂能力飼養(yǎng)層細(xì)胞通過各種分泌細(xì)胞因子和提供粘附面支持ESC生長飼養(yǎng)層細(xì)胞常用小鼠成纖維細(xì)胞系（如STO）、小鼠原代成纖維細(xì)胞（PMEF）或同源的成纖維細(xì)胞

ESC集落轉(zhuǎn)移1-2次后，生長加快，需1-2天換液，2-3天傳代ESC的培養(yǎng)體系飼養(yǎng)層細(xì)胞（feedercells）指在共27ESC的培養(yǎng)體系常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，添加谷氨酰胺、β-巰基乙醇等常用的細(xì)胞因子：

分化抑制因子LIF等

干細(xì)胞生長因子（SCF）、bFGF等生長因子hESC臨床應(yīng)用需采用無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)體系（可用條件培養(yǎng)基或提高bFGF等因子）；也不能使用FBS，可用血清替代品（KSG）ESC的培養(yǎng)體系常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，添加谷28hES

cellline,H9hEScellline,H929三、ES細(xì)胞的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定堿性磷酸酶（AKP）活性的檢測特異轉(zhuǎn)錄因子檢測（OCT-4,NANOG,SOX2等）特異檢測標(biāo)記（小鼠表達(dá)階段特異性胚胎抗原SSEA-1，靈長類表達(dá)SSEA-3/4、腫瘤排斥抗原TRA-1-60和Tra-1-81）核型分析體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)（畸胎瘤）體外分化實(shí)驗(yàn)（擬胚體自發(fā)分化）三、ES細(xì)胞的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定30人ES細(xì)胞特異性分子標(biāo)記的免疫熒光檢測人ES細(xì)胞特異性分子標(biāo)記的免疫熒光檢測31人ES細(xì)胞系的體內(nèi)分化（注入小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤）A神經(jīng)上皮細(xì)胞叢B骨骼C軟骨D橫紋肌E腎小球管F表皮樣結(jié)構(gòu)人ES細(xì)胞系的體內(nèi)分化（注入小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤）32Isolationofpluripotentembryonicstemcellsfromreprogrammedadultmousesomaticcellnuclei.

CurrentBiology,

2000Isolationofpluripotentembry33InvitrodifferentiationofhumanEScellunderavarietyofconditions人ES細(xì)胞的體外分化檢測Invitrodifferentiationofhu34四、ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化

撤去飼養(yǎng)層細(xì)胞和分化抑制因子，懸浮培養(yǎng)時，ES細(xì)胞形成類胚體（embryoidbody,EB），補(bǔ)充不同的細(xì)胞因子，EB將朝不同方向繼續(xù)分化。四、ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化撤去飼養(yǎng)層細(xì)胞和分化抑制因35ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的定向誘導(dǎo)去除分化抑制因子培養(yǎng)4天成類胚體（EB），加

視黃酸（RA），分化為神經(jīng)細(xì)胞前體，植入凝膠基質(zhì)，進(jìn)一步分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的定向誘導(dǎo)去除分化抑制因子培養(yǎng)4天成類胚體36RA誘導(dǎo)人ES細(xì)胞系分化前后的SSEA等標(biāo)記分子的表達(dá)RA誘導(dǎo)人ES細(xì)胞系分化前后的SSEA等標(biāo)記分子的表達(dá)37

人ES細(xì)胞誘導(dǎo)形成生血細(xì)胞集落

人ES細(xì)胞與小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞或卵黃囊內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)液：DMEM＋20％FBS＋2mMglutamine+0.1mMmercaptoethanol+1%NEAA人ES細(xì)胞誘導(dǎo)形成生血細(xì)胞集落38

HematopoieticcolonyderivedfromEScell(A,B6天，C10天)Hematopoieticcolonyderiv39猴ES細(xì)胞誘導(dǎo)形成胚胎血島樣結(jié)構(gòu)BMP-4,EPO,TPO，G-CSF,VEGF等細(xì)胞因子促進(jìn)ES細(xì)胞向造血細(xì)胞的分化猴ES細(xì)胞誘導(dǎo)形成胚胎血島樣結(jié)構(gòu)40五、ES細(xì)胞的應(yīng)用前景發(fā)育的細(xì)胞和分子機(jī)制研究作為外源基因?qū)氲氖荏w細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞移植療法和治療性克隆結(jié)合組織工程構(gòu)建人工器官疾病的動物模型和藥物篩選的細(xì)胞模型臨床應(yīng)用存在的困難：倫理學(xué)等社會因素導(dǎo)致材料來源的限制；材料處理的操作難度高；建系困難；定向誘導(dǎo)分化的效率較低；細(xì)胞移植有形成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)。五、ES細(xì)胞的應(yīng)用前景發(fā)育的細(xì)胞和分子機(jī)制研究臨床應(yīng)用存在的41細(xì)胞移植之路細(xì)胞移植之路42大學(xué)課程干細(xì)胞與組織工程課件43《人胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則》

2004年中國第四條：

禁止進(jìn)行生殖性克隆人的任何研究。第五條：用于研究的人胚胎干細(xì)胞只能通過下列方式獲得：

（一）體外受精時多余的配子或囊胚；（二）自然或自愿選擇流產(chǎn)的胎兒細(xì)胞；

（三）體細(xì)胞核移植技術(shù)所獲得的囊胚和單性分裂囊胚；

（四）自愿捐獻(xiàn)的生殖細(xì)胞。第六條：進(jìn)行人胚胎干細(xì)胞研究，必須遵守以下行為規(guī)范：

（一）利用體外受精、體細(xì)胞核移植、單性復(fù)制技術(shù)或遺傳修飾獲得的囊胚，其體外培養(yǎng)期限自受精或核移植開始不得超過14天。

（二）不得將前款中獲得的已用于研究的人囊胚植入人或任何其它動物的生殖系統(tǒng)。

（三）不得將人的生殖細(xì)胞與其他物種的生殖細(xì)胞結(jié)合。第七條：禁止買賣人類配子、受精卵、胚胎或胎兒組織。第八條：進(jìn)行人胚胎干細(xì)胞研究，必須認(rèn)真貫徹知情同意與知情選擇原則，簽署知情同意書，保護(hù)愛試者的隱私?！度伺咛ジ杉?xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則》2004年中國第四條44JamesThomsonJunyingYuShinyaYamanaka

Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science2007Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell2006Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell2007NobelPrizeinPhysiologyorMedicine

2012六、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞JamesThomsonJunyingYuSh45Inducedpluripotentstemcell（iPS

cell）：分化的體細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子后被重編程，成為具有自我更新和多向分化潛能的類ES細(xì)胞Inducedpluripotentstemcell（46iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)與鑒定誘導(dǎo)基因的選擇：Oct4,Sox2,c-myc,Klf4.或Oct4,Sox2,Nanog,Lin28誘導(dǎo)基因的導(dǎo)入方法：反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、質(zhì)粒等載體轉(zhuǎn)染iPS的鑒定：作為ES-likecell，鑒定方法同ESC，但應(yīng)另外鑒定外源性誘導(dǎo)基因的沉默和內(nèi)源性ESC特異轉(zhuǎn)錄因子的啟動iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)與鑒定47大學(xué)課程干細(xì)胞與組織工程課件48Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration.Science2008Generationofmouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors.Science2008（山中伸彌）Virus-freeinductionofpluripotencyandsubsequentexcisionofreprogrammingfactors.Nature2009piggyBac

transposition

reprograms

fibroblasts

to

induced

pluri-potent

stem

cells.

Nature2009Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins.CellStemCell2009iPS細(xì)胞誘導(dǎo)基因?qū)敕椒ǖ母倪M(jìn)Inducedpluripotentstemcells49iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementation.Nature2009iPScellsproduceviablemice50iPSC≠ESCiPS細(xì)胞是研究細(xì)胞重編程機(jī)制的重要模型，該技術(shù)在改進(jìn)藥物篩選、疾病建模和干細(xì)胞治療等方面具有巨大潛力，且避免倫理學(xué)爭議，但臨床應(yīng)用還要更慎重。Nature雜志同期發(fā)表了三篇論文分別針對iPS細(xì)胞的點(diǎn)突變、拷貝數(shù)變異及DNA甲基化特征進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)iPSC與ESC相比存在明顯的遺傳缺陷。Somaticcodingmutationsinhumaninducedpluripotentstemcells.Nature(2011)Copynumbervariationandselectionduringreprogrammingtopluripotency.Nature(2011)Hotspotsofaberrantepigenomicreprogramminginhumaninducedpluripotentstemcells.Nature(2011)iPSC≠ESCiPS細(xì)胞是研究細(xì)胞重編程機(jī)制的重要51DirectConversionofFibroblastsintoStablyExpandableNeuralStemCells.Cellstemcell,2012體細(xì)胞成體干細(xì)胞DirectConversionofFibroblas52體細(xì)胞不經(jīng)iPS直接誘導(dǎo)為成體干細(xì)胞有什么意義？體細(xì)胞不經(jīng)iPS直接誘導(dǎo)為成體干細(xì)胞有什么意義？53iPS技術(shù)誕生后，干細(xì)胞臨床治療的希望幾乎完全被寄托在iPSC上，治療性克隆研究步入低谷。隨著iPSC安全性問題的存在和體細(xì)胞核移植來源的人ESC的成功構(gòu)建，治療性克隆研究又重新被重視。iPS技術(shù)誕生后，干細(xì)胞臨床治療的希望幾乎完全被寄托在iPS54第二節(jié).成體干細(xì)胞第二節(jié).成體干細(xì)胞55成體/組織干細(xì)胞（somatic/tissuestemcell）：存在于動物組織中的未分化細(xì)胞，可以自我更新，并具有定向分化為所在組織中的各種類型細(xì)胞的潛能?；竟δ埽焊?、維持和修復(fù)所在組織器官，保持組織生長和衰退的動態(tài)平衡成體干細(xì)胞的可塑性（plasticity）：在特定條件下成體干細(xì)胞可能分化成其組織來源以外的細(xì)胞類型，實(shí)現(xiàn)跨系統(tǒng)甚至跨譜系的分化。也稱為干細(xì)胞的橫向分化成體/組織干細(xì)胞（somatic/tissuestemc56大學(xué)課程干細(xì)胞與組織工程課件57一、造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞（hematopoieticstemcell，HSC）：存在于骨髓、外周血和臍帶血中，體內(nèi)分化為各種血細(xì)胞一、造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞（hematopoieticste58DevelopmentofhaematopoieticstemcellsDevelopmentofhaematopoietic59造血干細(xì)胞的特征HSC呈圓形，直徑8微米，骨髓中數(shù)量占有核細(xì)胞總數(shù)的1%分為長期HSC、短期HSC（保持8個月的自我更新能力）和多功能祖細(xì)胞（失去自我更新能力，進(jìn)入分化通道）細(xì)胞表面標(biāo)志：hHSC上發(fā)現(xiàn)最早也是最常用的標(biāo)志分子是CD34，大部分CD34陽性細(xì)胞也表達(dá)CD133和CDCP1，其它表面標(biāo)志隨著個體發(fā)育階段的不同有變化，但這些標(biāo)志并非HSC特異的。造血干細(xì)胞的特征HSC呈圓形，直徑8微米，骨髓中數(shù)量占有核細(xì)60造血干細(xì)胞的分離非抗體介導(dǎo)分離法利用密度梯度離心將造血干細(xì)胞與密度較大的細(xì)胞（紅細(xì)胞和有粒白細(xì)胞）分開，結(jié)合藥物如氟尿嘧啶（5-FU），殺死分裂期的淋巴細(xì)胞，留下純度較高的HSC?？贵w介導(dǎo)分離法借助抗體將特定細(xì)胞吸附在燒瓶、柱子或磁珠等基質(zhì)上，從而將陽性細(xì)胞與其它細(xì)胞分開。分為陽性選擇法和陰性選擇法。人HSC陽性篩選時最常用的是針對CD34的抗體。造血干細(xì)胞的分離非抗體介導(dǎo)分離法61造血干細(xì)胞移植骨髓動員：以細(xì)胞因子刺激骨髓HSC遷移到外周血，常用的動員劑是重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）等HSC歸巢：HSC經(jīng)靜脈輸入人體，與基質(zhì)細(xì)胞、髓竇內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓基質(zhì)內(nèi)各種粘附分子相互作用，并受細(xì)胞因子調(diào)節(jié)而植入骨髓干細(xì)胞龕（niche）內(nèi)，重建造血功能造血干細(xì)胞移植骨髓動員：以細(xì)胞因子刺激骨髓HSC遷移到外周血62對歸巢起作用的最重要分子是趨化因子SDF-1，骨髓內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)的SDF-1與CD34+細(xì)胞表面的受體CXCR4結(jié)合，從而捕獲造血干/祖細(xì)胞對歸巢起作用的最重要分子是趨化因子SDF-1，骨髓內(nèi)皮細(xì)胞等63臍帶血儲備的意義造血干/祖細(xì)胞豐富其中淋巴細(xì)胞大多為幼稚型T細(xì)胞，免疫反應(yīng)弱進(jìn)入細(xì)胞周期的干細(xì)胞較多，可作為遺傳病治療的靶細(xì)胞干細(xì)胞可長期貯備采集臍帶血對供者無影響臍帶血儲備的意義造血干/祖細(xì)胞豐富64二、間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcell，MSC）是存在于骨髓及骨髓外多個組織的多能干細(xì)胞，可分化為各種間充質(zhì)細(xì)胞。二、間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalste65MSC的生物學(xué)特征體外形態(tài)：先貼壁呈成纖維細(xì)胞樣，之后部分形成集落，處于相對靜息期和活躍期的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯不同體內(nèi)作用：參與組織細(xì)胞的更新和受損組織的修復(fù)。支持HSC的增殖和分化；自身可分化為造血實(shí)質(zhì)細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，還可分化為造血系統(tǒng)以外的細(xì)胞表面標(biāo)志：來源于不同組織的MSC在形態(tài)、分化能力和基因表達(dá)上不同，但表達(dá)相似的標(biāo)志物：CD73、CD90和CD105，不表達(dá)CD34、CD45、CD14、HLA-DR等MSC的生物學(xué)特征體外形態(tài)：先貼壁呈成纖維細(xì)胞樣，之后部分形66MSC的分離密度梯度離心法差異貼壁篩選法流式細(xì)胞儀分選法免疫磁珠分選法MSC的分離密度梯度離心法67大鼠，乙醚麻醉，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒5min。剝離股骨和脛骨，置于75%酒精的燒杯中，移入超凈臺。將脛骨、股骨置于培養(yǎng)皿中加入10mlPBS，進(jìn)一步剝離附著組織，少量PBS沖洗，加入12mlDMEM完全培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中剪斷骨干兩端，注射器吸取培養(yǎng)基插入一頭斷端將骨髓從另一頭沖出，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液。離心管中加入10mlPercoll分離液，將細(xì)胞懸液傾斜緩緩加入（不能沖破Percoll分離液面），用8ml培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)皿，再加入離心管。2500-3000rpm離心30min，先吸去上層紅色培養(yǎng)基層，將吸管伸至中間白色絮狀層將其緩慢吸出移至另一離心管。加20mlPBS反復(fù)吹打混勻，1800rpm離心10min，棄上清。重復(fù)離心一次，棄上清。加入5ml完全培養(yǎng)基，吹打混勻，接種于培養(yǎng)瓶中。BMSC的分離培養(yǎng)大鼠，乙醚麻醉，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒5min。68MSC的研究意義和應(yīng)用MSC是研究干細(xì)胞可塑性的最好模型取材方便，容易體外培養(yǎng)，是臨床細(xì)胞治療和基因治療較理想的載體具有多向分化潛能，在很多組織修復(fù)方面有巨大的潛力：如心肌修復(fù)、骨骼重建、皮膚修復(fù)及神經(jīng)退行性疾病的治療等具有免疫調(diào)節(jié)功能，表現(xiàn)為免疫抑制和抑制炎癥反應(yīng)，臨床上可移植MSC以終止破壞性的炎癥反應(yīng)具有腫瘤細(xì)胞趨向性，可利用其作為靶向治療的載體細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因的MSC在腫瘤部位表達(dá)特定物質(zhì)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，以定向殺死腫瘤細(xì)胞MSC的研究意義和應(yīng)用MSC是研究干細(xì)胞可塑性的最好模型69三、神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcell，NSC）是指可以分化為神經(jīng)系統(tǒng)各類細(xì)胞的專能干細(xì)胞。成年動物NSC主要集中在室管膜下區(qū)（SVZ）和海馬齒狀回顆粒下區(qū)（SGZ）。三、神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcell，70NSC的生物學(xué)特征體外形態(tài)：圓形，聚集成團(tuán)，稱為神經(jīng)球（neurophere），其中含有神經(jīng)干/祖細(xì)胞、各類神經(jīng)前體細(xì)胞（NPC）及分化的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等NSC多處于靜息狀態(tài)，不表達(dá)成熟的表面抗原，因此免疫原性較弱，移植后的免疫排斥較輕分子標(biāo)志：胞質(zhì)nestin是目前最常用的神經(jīng)干/祖細(xì)胞標(biāo)志物，也可用表面標(biāo)志LeX和CD133NSC分化伴隨了NPC的遷移：發(fā)育階段遷移到特定部位才能分化出具特殊功能的神經(jīng)元；NSC移植存活后也可遷移出移植區(qū)，與宿主組織建立突觸聯(lián)系NSC的生物學(xué)特征體外形態(tài)：圓形，聚集成團(tuán)，稱為神經(jīng)球（ne71NSC的分離培養(yǎng)和建系從胚胎神經(jīng)組織或成體腦組織分離，方法：機(jī)械分離、酶消化、流式細(xì)胞儀分選、免疫磁珠法等體外培養(yǎng)通常采用無血清培養(yǎng)，避免血清成分刺激分化?；A(chǔ)培養(yǎng)液DMEM/F12，添加B27或N2作能源，添加EGF和bFGF促進(jìn)增殖可以貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)（即神經(jīng)球法，球直徑100-200微米時傳代）NSC體外增殖活性低，容易分化，通過導(dǎo)入原癌基因的方法可使其永生化，建立細(xì)胞系（如C17.2）NSC的分離培養(yǎng)和建系從胚胎神經(jīng)組織或成體腦組織分離，方法：72NSC的臨床應(yīng)用干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾?。≒D，HD，AD）NSC對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具趨向性，可跟蹤轉(zhuǎn)移的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)靶向治療也可作為轉(zhuǎn)基因治療的載體細(xì)胞NSC的臨床應(yīng)用干細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾?。≒D，HD，A73四、表皮干細(xì)胞表皮干細(xì)胞（Epidermal

stem

cell）位于表皮基底層和毛囊根部的專能干細(xì)胞，能分化為表皮中各種類型細(xì)胞，終生維持表皮組織的自我更新四、表皮干細(xì)胞表皮干細(xì)胞（Epidermal

stem

ce74表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性標(biāo)志分子：干細(xì)胞：角蛋白（keratin）K8、K15、K18、K19，α6和β1整合素（integrin）祖細(xì)胞：K5、K14、β1分化的表皮細(xì)胞：K1、K10ESC通過表達(dá)整合素實(shí)現(xiàn)對基底膜的粘附作用ESC常處于G0期，細(xì)胞大小是形成克隆的決定因素表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性標(biāo)志分子：75表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)76表皮干細(xì)胞的應(yīng)用皮膚損傷修復(fù)皮膚組織工程（人工皮膚）基因治療載體表皮干細(xì)胞的應(yīng)用皮膚損傷修復(fù)77五、腫瘤干細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞（tumorstemcell，TSC）是存在于腫瘤組織中的極少數(shù)具有干細(xì)胞性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞群體五、腫瘤干細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞（tumorstemcell，T78腫瘤干細(xì)胞學(xué)說腫瘤組織中存在的極少量充當(dāng)干細(xì)胞角色的腫瘤細(xì)胞（即腫瘤干細(xì)胞）在啟動腫瘤形成和生長中具有決定性作用。理論依據(jù)：干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相似性形態(tài)上幼稚；無限增殖能力；調(diào)節(jié)自我更新的機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；遷移或轉(zhuǎn)移能力；異質(zhì)性；端粒酶活性；分化和轉(zhuǎn)分化能力。因此腫瘤可能起源于干細(xì)胞。有大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察證實(shí)TSC的存在，但至今沒有分離到TSC的報(bào)道。ReyaT.etal.Stemcells,cancer,andcancerstemcells.Nature,2001腫瘤干細(xì)胞學(xué)說腫瘤組織中存在的極少量充當(dāng)干細(xì)胞角色的腫瘤細(xì)胞79

Signallingpathwaysthatregulateself-renewalmechanismsduringnormalstemcelldevelopmentandduringtransformation.

Signallingpathwaysthatregu80腫瘤干細(xì)胞存在的臨床意義Conventionaltherapiesmayshrinktumoursbykillingmainlycellswithlimitedproliferativepotential.腫瘤干細(xì)胞存在的臨床意義Conventionalthera81第三節(jié).組織工程第三節(jié).組織工程821980年Burke和Yannas將皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞接種在蛋白支架上，第一次得到具有真皮層的人工皮膚1995年CharlesVacanti將人軟骨細(xì)胞-支架一起植入裸鼠背部，長出人耳的小鼠引起廣泛爭議1980年Burke和Yannas將皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞83組織工程（tissueengineering）是利用工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理、方法和技術(shù)在體外構(gòu)建有活性的組織器官，以達(dá)到修復(fù)缺損組織的目的?；驹恚簩⒆泽w或異體的細(xì)胞體外擴(kuò)增，作為種子細(xì)胞接種到構(gòu)建好的生物活性支架上，這種支架良好的生物相容性和添加的基質(zhì)成分支持細(xì)胞遷移、鋪展、生長和分化，形成具有特定形態(tài)和功能活性的細(xì)胞-材料復(fù)合物。移植到受損組織器官內(nèi)，生物材料可降解吸收，細(xì)胞不斷增殖，與受體器官形成一個有機(jī)整體。一、組織工程的原理組織工程（tissueengineering）是利用工程學(xué)84組織工程的核心要素：種子細(xì)胞、三維支架組織工程的核心要素：種子細(xì)胞、三維支架85種子細(xì)胞：具有較強(qiáng)的增殖能力；能分化成工程化組織期望的細(xì)胞；能適應(yīng)生物支架。可來源于自體、異體或異種各類干細(xì)胞是最理想的種子細(xì)胞生物支架（scaffold）：具有生物活性，支持細(xì)胞增殖分化；有合適的空隙率和強(qiáng)度；具有良好生物相容性和低免疫原性；可降解。包括天然材料、人工合成高分子聚合物、復(fù)合材料三類種子細(xì)胞：具有較強(qiáng)的增殖能力；能分化成工程化組織期望的細(xì)胞；86組織工程技術(shù)的關(guān)鍵步驟種子細(xì)胞的分離培養(yǎng)三維支架材料的構(gòu)建細(xì)胞的接種和灌注培養(yǎng)意義人工組織器官移植再生醫(yī)學(xué)（regenerativemedicine）組織工程技術(shù)的關(guān)鍵步驟意義人工組織器官移植87二、組織工程的臨床應(yīng)用構(gòu)建人工組織器官，用于替代或修復(fù)因老化、手術(shù)、受傷、疾病或遺傳因素等造成的器官功能缺損，屬于再生醫(yī)學(xué)（regenerativemedicine）二、