常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用（人衛(wèi)9版）課件

作者:藥立波單位:第四軍醫(yī)大學(xué)第二十四章

常用分子生物學(xué)技術(shù)BasicTechniquesinMolecularBiology作者:藥立波單位:第四軍醫(yī)大學(xué)第二十四章常用分第一節(jié)分子雜交和印跡技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用第三節(jié)DNA測序技術(shù)第四節(jié)生物芯片技術(shù)第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離、純化與結(jié)構(gòu)分析第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)第一節(jié)分子雜交和印跡技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用重點(diǎn)難點(diǎn)熟悉了解掌握印記技術(shù)的概念；PCR技術(shù)的概念，原理、用途；DNA序列測定的概念和用途；生物芯片的概念；蛋白質(zhì)分離純化的主要技術(shù)所依據(jù)的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)印記技術(shù)的種類；實(shí)時PCR技術(shù)的原理和用途；新一代DNA序列測定的概念和用途；生物芯片的用途；蛋白質(zhì)分離純化的主要方法的概念和應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的意義；基因文庫的概念；蛋白質(zhì)分離純化的主要方法及其基本原理；多肽鏈中氨基酸的序列分析方法及其原理；蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定的基本原理；蛋白質(zhì)相互作用分析的主要方法和意義重點(diǎn)難點(diǎn)熟悉了解掌握印記技術(shù)的概念；PCR技術(shù)的概念，原理、分子雜交和印記技術(shù)第一節(jié)MolecularHybridizationandBlottingTechnique分子雜交和印記技術(shù)第一節(jié)MolecularHybridiz不同的DNA或RNA分子之間，或DNA分子與RNA分子之間，按照堿基互補(bǔ)配對的原則，兩條完全或不完全互補(bǔ)的多核苷酸鏈相互結(jié)合、形成雜交分子的過程一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理分子雜交(molecularhybridization)

不同的DNA或RNA分子之間，或DNA分子與RNA分子之間，復(fù)性RNADNA

分子雜交技術(shù)復(fù)性RNADNA分子雜交技術(shù)印跡技術(shù)是將待檢測的生物大分子轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上，再通過分子雜交，使其得到顯現(xiàn)的過程。通過印跡技術(shù)不僅能夠檢測DNA或RNA分子，還能夠利用抗原、抗體相互識別結(jié)合的特點(diǎn)，對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行檢測。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，即印跡技術(shù)印跡技術(shù)是將待檢測的生物大分子轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上，再通過分子雜

探針（probe）指的是帶有特殊可檢測標(biāo)記的多聚核苷酸片段放射性核素、生物素或熒光染料可以標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列探針可以與固定在NC膜上的核苷酸互補(bǔ)結(jié)合可以用于檢測核酸樣本中存在的特定基因探針技術(shù)探針（probe）指的是帶有特殊可檢測標(biāo)記的多二、分子雜交和印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用

DNA印跡(SouthernBlotting)[SouthernEM,1975]

RNA印跡(NorthernBlotting)

[AlwineJC，KempDJandStarkGR,1977]

蛋白質(zhì)的印跡(WesternBlotting)

[TowbinH,StaehelinTandGordonJ,1979]用于克隆基因的酶切圖譜、基因組中某一基因的定性及定量、基因突變、基因拷貝數(shù)及限制性片段長度多態(tài)性分析等

用于RNA的定性定量分析用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究二、分子雜交和印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用DNA印跡(SouthDNA印跡實(shí)驗(yàn)①②③④⑤DNA印跡實(shí)驗(yàn)①②③④⑤

三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較其他雜交或印記技術(shù)斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)組織原位雜交細(xì)胞染色體DNA原位雜交菌落原位雜交

DNA芯片技術(shù)(DNAchip)其他雜交或印記技術(shù)

原位分子雜交技術(shù)基本原理：利用標(biāo)記的核酸分子探針與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA結(jié)合，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定，具有能與待測特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列（探針），以及與探針結(jié)合的標(biāo)記物原位雜交是進(jìn)行基因及其表達(dá)產(chǎn)物定位分析的一種技術(shù)原位分子雜交技術(shù)基本原理：利用標(biāo)記的核酸分子探針與組織、細(xì)分析基因在染色體上的位置

DNA熒光原位雜交確定特定基因的表達(dá)定位

RNA原位雜交

原位分子雜交技術(shù)分析基因在染色體上的位置原位分子雜交技術(shù)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

PrincipleandApplicationofPolymeraseChainReaction第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用

PrincipleandAppl簡稱PCR，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程在體外獲得大量DNA的技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)

(ThePolymeraseChainReaction,PCR)簡稱PCR，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程在體外獲得大量DNA的一、PCR技術(shù)的基本原理以待擴(kuò)增的DNA分子為模板，用兩條寡核苷酸片段作為引物，分別在擬擴(kuò)增片段的DNA兩側(cè)與模板DNA鏈互補(bǔ)結(jié)合，提供3'-OH末端；在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成兩條新鏈的合成。不斷重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增一、PCR技術(shù)的基本原理以待擴(kuò)增的DNA分子為模板，用兩條寡模板（template）：DNA雙鏈原料（material）：四種dNTP催化酶（enzyme）：耐熱的DNA聚合酶引物（primer）：兩條

Mg2+緩沖液基本反應(yīng)過程一對模板變性開二條引物退火連三種溫度交替變四種原料來延伸PCR體系基本組成成分變性退火延伸模板（template）：DNA雙鏈原料（materi基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C（50-65?C）產(chǎn)物：兩引物之間特異的DNA片段

變性（94~96°C

）退火（50~65°C）延伸（72°C）基本反應(yīng)步驟變性延伸退火產(chǎn)物：兩引物之間特異的DNA片段

PCR工作原理示意圖PCR工作原理示意圖二、PCR技術(shù)的主要用途（一）獲得目的基因片段在人類基因組計(jì)劃完成之前，PCR是從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的新基因片段或新基因的主要方法。目前，該技術(shù)是從各種生物標(biāo)本或基因工程載體中快速獲得已知序列目的基因片段的主要方法（二）DNA和RNA的微量分析PCR技術(shù)敏感性高，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。理論上講，1滴血液、1根毛發(fā)或1個細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景（三）DNA序列分析將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度，是實(shí)現(xiàn)高通量DNA序列分析的基礎(chǔ)。待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測定，也可直接測定二、PCR技術(shù)的主要用途（一）獲得目的基因片段（四）基因突變分析PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性，例如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、等位基因特異的寡核苷酸探針分析、基因芯片技術(shù)、DNA序列分析等（五）基因的體外突變在PCR技術(shù)建立以前，在體外對基因進(jìn)行各種突變是一項(xiàng)費(fèi)時費(fèi)力的工作。現(xiàn)在，利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對目的基因片段進(jìn)行插入、嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造（四）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法

逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionP24

逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)常用引物AAAAAA3’

寡核苷酸dT5’mRNATTTTTT5’AAAAAA3’

隨機(jī)引物5’mRNAAAAAAA3’

特異性引物5’mRNA24逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)常用引物AAAAAA3’

逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)原理逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)原理三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)

原位PCR技術(shù)利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的基因片段PCR反應(yīng)在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片或細(xì)胞涂片上的單個細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)后，再用特異性探針進(jìn)行原位雜交即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在原位PCR將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合，既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)原位PCR技術(shù)利用完整的細(xì)胞作

實(shí)時PCR技術(shù)實(shí)時PCR(real-timePCR)技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法實(shí)時技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)實(shí)時PCR技術(shù)實(shí)時PCR(real-timePCR)

實(shí)時PCR技術(shù)原理-非引物探針類實(shí)時PCR最常用的熒光染料為SYBRGreen，它能結(jié)合到DNA雙螺旋小溝區(qū)域F熒光物質(zhì)FFFFFFFF引物聚合酶F實(shí)時PCR技術(shù)原理-非引物探針類實(shí)時PCR最常用的熒光染料引物探針類實(shí)時PCR

TaqMan探針法

FRET探針法分子信標(biāo)探針法引物探針類實(shí)時PCRTaqMan探針法FRET

實(shí)時PCR技術(shù)原理-TaqMan探針法實(shí)時PCR技術(shù)原理-TaqMan探針法

實(shí)時PCR技術(shù)原理-分子信標(biāo)引物探針法FQQF分子信標(biāo)靶基因雜交體F:熒光報告基因；Q:熒光淬滅基因?qū)崟rPCR技術(shù)原理-分子信標(biāo)引物探針法FQQF分子信標(biāo)靶基實(shí)時定量PCR技術(shù)具有定量、特異、靈敏和快速等特點(diǎn)，是目前檢測目的核酸拷貝數(shù)的可靠方法，是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。目前實(shí)時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域

實(shí)時PCR的應(yīng)用實(shí)時PCR在腫瘤方面的應(yīng)用實(shí)時PCR用于多態(tài)性分析實(shí)時PCR用于病原體的檢測實(shí)時定量PCR技術(shù)具有定量、特異、靈敏和快速等特點(diǎn)，是目前檢DNA測序技術(shù)DNA

Sequencing第三節(jié)DNA測序技術(shù)第三節(jié)四、DNA測序在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價值三、高通量DNA測序技術(shù)使基因測序走向醫(yī)學(xué)實(shí)用二、第一代全自動激光熒光DNA測序儀器基于雙脫氧法一、雙脫氧法和化學(xué)降解法是經(jīng)典DNA測序方法四、DNA測序在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價值三、高通量DNA測序一、雙脫氧法和化學(xué)降解法是經(jīng)典DNA測序方法

DNA鏈末端合成終止法一、雙脫氧法和化學(xué)降解法是經(jīng)典DNA測序方法DNA鏈末端二、第一代全自動激光熒光DNA測序儀器基于雙脫氧法早期的全自動DNA序列分析儀的工作原理主要是基于Sanger法，采用四色熒光標(biāo)記ddNTP而制作的。采用4種不同熒光染料標(biāo)記4種不同的可終止DNA延伸反應(yīng)的底物ddNTP，經(jīng)Sanger法反應(yīng)后，賦予所合成的DNA片段4種不同的顏色。待測DNA樣品的4個反應(yīng)產(chǎn)物在同一個泳道內(nèi)依照片段大小電泳分離，由儀器自動連續(xù)采集熒光數(shù)據(jù)并完成分析，最后直接顯示待測DNA的堿基序列二、第一代全自動激光熒光DNA測序儀器基于雙脫氧法早期的全自三、高通量DNA測序技術(shù)使基因測序走向醫(yī)學(xué)實(shí)用人群及個體進(jìn)行全基因組序列分析必須實(shí)現(xiàn)DNA測序技術(shù)的微量、快速和低成本化新的高通量DNA測序技術(shù)及其分析儀器因此應(yīng)運(yùn)而生。這些新技術(shù)被冠予新一代測序（nextgenerationsequencing，NGS）之稱三、高通量DNA測序技術(shù)使基因測序走向醫(yī)學(xué)實(shí)用人群及個體進(jìn)行新一代測序技術(shù)

焦磷酸測序（Pyrosequencing）循環(huán)芯片測序（cyclic-arraysequencing）單分子實(shí)時測序新一代測序技術(shù)焦磷酸測序（Pyroseque二、DNA序列分析的主要用途通過DNA序列分析可以鑒定基因和基因組的變異通過DNA序列測定分析人工重組的基因通過DNA序列測定對定點(diǎn)突變進(jìn)行確認(rèn)二、DNA序列分析的主要用途通過DNA序列分析可以鑒定基因生物芯片技術(shù)BiochipTechnologies第四節(jié)生物芯片技術(shù)第四節(jié)是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一位點(diǎn)的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)

一、基因芯片

基因芯片(genechip)是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支利用DNA芯片技術(shù)可同時進(jìn)行高通量基因轉(zhuǎn)錄活性的分析染色質(zhì)免疫共沉淀與芯片技術(shù)結(jié)合檢測蛋白質(zhì)-DNA相互作用（ChIP-on-chip）確定轉(zhuǎn)錄因子及其作用位點(diǎn)確定基因表觀遺傳修飾，應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)研究基因芯片技術(shù)的應(yīng)用利用DNA芯片技術(shù)可同時進(jìn)行高通量基因基因芯片技術(shù)的應(yīng)用

基因芯片分析腫瘤差異表達(dá)基因基因芯片分析腫瘤差異表達(dá)基因是將高度密集排列的蛋白質(zhì)分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白質(zhì)樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)二、蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)檢測芯片蛋白質(zhì)功能芯片是將高度密集排列的蛋白質(zhì)分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，

蛋白質(zhì)芯片作用原理--蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片作用原理--蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)是將數(shù)十個、數(shù)百個乃至上千個小的處于自然或病理狀態(tài)下的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上（通常是載玻片）形成微縮組織切片，以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，在組織切片上高通量獲取基因的表達(dá)信息的一種技術(shù)

組織芯片(tissuechip，tissuemicroarray)多組織片組織陣列組織微陣列胃癌患者的組織芯片（免疫組化染色）是將數(shù)十個、數(shù)百個乃至上千個小的處于自然或病理狀態(tài)下的組織標(biāo)蛋白質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)分析Isolation,PurificationandStructuralAnalysisofProteins第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)分析第五節(jié)一、有機(jī)溶劑沉淀、鹽析及免疫沉淀用于蛋白質(zhì)濃縮及分離

有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)沉淀，再將其溶解在小體積溶劑中即可獲得濃縮的蛋白質(zhì)溶液為保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性，需要在0～4℃低溫下進(jìn)行丙酮或乙醇沉淀沉淀后應(yīng)立即分離，否則蛋白質(zhì)會發(fā)生變性一、有機(jī)溶劑沉淀、鹽析及免疫沉淀用于蛋白質(zhì)濃縮及分離有機(jī)溶鹽析分離蛋白質(zhì)將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀各種蛋白質(zhì)鹽析時所需的鹽濃度及pH均不同，可據(jù)此將不同的蛋白質(zhì)予以分離鹽析分離蛋白質(zhì)將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋免疫沉淀分離蛋白質(zhì)利用特異抗體可以識別相應(yīng)抗原并形成抗原抗體復(fù)合物的特性，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得相應(yīng)的抗原蛋白用于特定蛋白質(zhì)定性和定量分析將抗體交聯(lián)至固相化的瓊脂糖珠上，易于獲得抗原抗體復(fù)合物免疫沉淀分離蛋白質(zhì)利用特異抗體可以識別相應(yīng)抗原并形成抗原抗體二、透析和超濾法去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法透析（dialysis）二、透析和超濾法去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物利用透析袋把大超濾法（ultra-filtration）應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的超濾膜蛋白質(zhì)溶液離心超濾法（ultra-filtration）應(yīng)用正壓或離心力三、電泳分離蛋白質(zhì)電泳：蛋白質(zhì)分離與鑒定的常用方法蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等三、電泳分離蛋白質(zhì)電泳：蛋白質(zhì)分離與鑒定的常用方法蛋白質(zhì)在幾種重要的蛋白質(zhì)電泳SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：常用于蛋白質(zhì)分子量的測定IEE等電聚焦電泳：通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法2-DGE雙向凝膠電泳：蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)幾種重要的蛋白質(zhì)電泳SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：常用樣品加于凝膠上部的上樣孔內(nèi)，在電場的作用下，蛋白質(zhì)分子根據(jù)其固有

的帶電性和分子大小進(jìn)行分離b.凝膠經(jīng)染料（例如：考馬斯亮藍(lán)）染色后，蛋白質(zhì)條帶得以顯現(xiàn)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品加于凝膠上部的上樣孔內(nèi)，在電場的作用下，蛋白質(zhì)分子根據(jù)其凝膠中加入系列兩性電解質(zhì)載體，在電場中形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，樣品加于凝膠上部，蛋白質(zhì)根據(jù)不同的等電點(diǎn)被分離IEE等電聚焦電泳凝膠中加入系列兩性電解質(zhì)載體，在電場中形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線雙向凝膠電泳第一相：等電聚焦電泳將蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)進(jìn)行分離將等電聚焦電泳的凝膠置于水平的SDS凝膠的上樣處第二相：SDS電泳將蛋白質(zhì)按分子量進(jìn)行分離。圖中水平方向代表了蛋白質(zhì)等電點(diǎn)

的差別，垂直方向代表了蛋白質(zhì)分子量的差別雙向凝膠電泳第一相：等電聚焦電泳將蛋白質(zhì)按等電點(diǎn)進(jìn)行分離四、層析分離蛋白質(zhì)層析（chromatography）又稱色譜法，是根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的四、層析分離蛋白質(zhì)層析（chromatography）又稱色

離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離是根據(jù)天然蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱分子篩層析凝膠過濾層析凝膠過濾層析五、蛋白質(zhì)顆粒沉降行為與超速離心分離超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)在離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)五、蛋白質(zhì)顆粒沉降行為與超速離心分離超速離心法(ultra因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測六、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析（一）用化學(xué)方法測定肽鏈的氨基酸序列（二）通過核酸來推演蛋白質(zhì)的氨基酸序列得到一個蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)有兩種基本策略六、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析（一）用化學(xué)方法測定肽鏈的氨基酸序列水解法分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組分標(biāo)記和測定多肽鏈的N端與C端的氨基酸殘基測定各肽段的氨基酸序列（Edman降解法、質(zhì)譜法）把肽鏈水解成片段至少要用兩種方法裂解多肽鏈，這兩套肽段要逐一測序，最后根據(jù)其重疊區(qū)確定這些肽段的排列次序，從而得到整條肽鏈的一級結(jié)構(gòu)用化學(xué)分析方法測定肽鏈的氨基酸序列水解法分析已純化蛋白質(zhì)的標(biāo)記和測定多肽鏈的N端與C端的氨基酸水解法分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組分蛋白質(zhì)水解后用離子交換層析分析其氨基酸組分蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解后成為個別氨基酸，用離子交換樹脂將各種氨基酸分開，測定它們的含量，算出各氨基酸在蛋白質(zhì)中的百分組成或個數(shù)水解法分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組分蛋白質(zhì)水解后用離子交換標(biāo)記和測定多肽鏈的N端與C端的氨基酸殘基氨基酸和肽的末端測定法化學(xué)法二硝基氟苯法（DNP法）肼解法二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）還原成氨基醇法酶解法亮氨酸氨肽酶法羧肽酶A法細(xì)胞外氨肽酶法羧肽酶B法羧肽酶C法標(biāo)記和測定多肽鏈的N端與C端的氨基酸殘基溴化氰溴化氰N端C端胰蛋白酶LysArgPheTyrTrpMetMet胰凝乳蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶溴化氰溴化氰N端C端胰蛋白酶LysArgPheTyrTrpM氨基酸分析第二個分析循環(huán)+PITC+PITC待測肽段TFA裂解切除了N端氨基酸的肽段Edman降解法氨基酸分析第二個分析循環(huán)+PITC+PITC待測肽段TFA裂通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質(zhì)的基因測定DNA序列排列出mRNA序列通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨七、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)分析通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。-螺旋的CD峰有222nm處的負(fù)峰、208nm處的負(fù)峰和198nm處的正峰3個成分；而-折疊的CD譜不很固定圓二色光譜可估算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比例七、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)分析通常采用圓二色光譜(circular蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)解析X射線衍射法（X-raydiffraction）需要首先將蛋白質(zhì)制備成晶體，X射線射至蛋白質(zhì)晶體上，產(chǎn)生不同方向的衍射，收集衍射光束所產(chǎn)生的電子密度圖，可計(jì)算出空間結(jié)構(gòu)核磁共振技術(shù)（nuclearmagneticresonance,NMR）主要用于測定蛋白質(zhì)的液相三維空間結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡（cryo-electronmicroscopy）技術(shù)的發(fā)明極大提高了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析速度和分辨率，而且可以分析蛋白質(zhì)在相對天然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，當(dāng)前已經(jīng)成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要研究手段蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)解析X射線衍射法（X-raydiffra從頭預(yù)測法

:用分子力學(xué)、分子動力學(xué)的方法，根據(jù)物理化學(xué)的基本原理，計(jì)算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)方法預(yù)測三維空間結(jié)構(gòu)同源建模法（homologymodeling）:又稱為比較建模法，是根據(jù)大量已知的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)來預(yù)測序列已知而結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的方法主要有兩類從頭預(yù)測法:用分子力學(xué)、分子動力學(xué)的方法，根據(jù)物理化學(xué)的生物大分子相互作用研究技術(shù)TechnologiesforAnalyzingInteractionofBiologicalMacromolecular第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)第六節(jié)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選一、常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)酵母雙雜交一、常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)主要用于證明兩種蛋白質(zhì)分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外

GST融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)將蛋白X的編碼基因插到GST編碼序列的下游，表達(dá)為GST-蛋白X融合蛋白該融合蛋白的GST部分可以與偶聯(lián)在瓊脂糖珠上的GSH結(jié)合；蛋白Y可以籍與蛋白X