園藝植物組織培養(yǎng)第8章課件

第八章離體授粉第八章離體授粉1花的組成與基本結(jié)構(gòu)花花柄Pedicel花托Receptacle花被Perianth雄蕊群Androecium雌蕊群Gynoecium花藥Anther花絲Filament子房Ovary花柱Style柱頭Stigma花的組成與基本結(jié)構(gòu)花花柄Pedicel花藥Ant2園藝植物組織培養(yǎng)第8章ppt課件3園藝植物組織培養(yǎng)第8章ppt課件48.1.1進(jìn)行離體授粉的目的克服受精前障礙。

8.1離體授粉的方法8.1.1進(jìn)行離體授粉的目的克服受精前障礙。8.1離5造成受精障礙的因素：①花粉在柱頭上不能萌發(fā)；②花粉管不能進(jìn)人胚珠，造成這種現(xiàn)象的原因或是由于花柱太長，或是由于花粉管生長速度太慢，還沒長到花柱基部子房已經(jīng)脫落；③花粉管在花柱中破裂。造成受精障礙的因素：①花粉在柱頭上不能萌發(fā)；②花粉管6克服受精前障礙的方法：蕾期授粉，截斷花柱，對花柱進(jìn)行熱處理，輻照處理，混合花粉授粉等。

克服受精前障礙的方法：蕾期授粉，截斷花柱，對花柱進(jìn)78.1.2離體授粉的含義離體胚珠授粉：將花粉授于離體的胚珠上，進(jìn)而實現(xiàn)受精作用的方法子房授粉：將花粉粒直接送入子房以實現(xiàn)受精作用的方法。

離體授粉:把通過在培養(yǎng)的整個雌蕊的柱頭上授粉而結(jié)實的方法稱為離體授粉。離體授粉包括：8.1.2離體授粉的含義離體胚珠授粉：子房授粉：將花8離體胎座授粉：把花粉授于連在胎座的胚珠上，進(jìn)而實現(xiàn)受精作用的方法離體柱頭授粉：把花粉授于離體子房的柱頭上，進(jìn)而實現(xiàn)受精作用的方法試管受精：離體的卵細(xì)胞和自由游動的精子在體外的融合。離體胎座授粉：把花粉授于連在胎座的胚珠上，進(jìn)而實現(xiàn)受精作用9園藝植物組織培養(yǎng)第8章ppt課件10離體授粉的應(yīng)用：克服自交不親和克服雜交不親和通過孤雌生殖產(chǎn)生單倍體離體授粉的應(yīng)用：118.1.3離體授粉的方法

子房授粉的方法：

由開裂的花藥中采集花粉，將之懸浮于含有100mg/L硼酸的無菌重蒸餾水中，密度為每滴懸浮液100-300個花粉粒。

在開花之前2d，將用做母本的花去雄套袋。

開花以后，將子房用酒精棉進(jìn)行表面消毒。8.1.3離體授粉的方法子房授粉的方法12

在子房兩側(cè)彼此相對的位置上鉆2個小孔，用注射器由1個小孔向子房內(nèi)注入花粉懸浮液，子房內(nèi)的空氣則由另1個小孔排出。懸浮液要注滿子房腔，直到開始由另一小孔中流出為止。注射完畢以后，將2個小孔用凡士林封閉。

也可通過一個小縫送人花粉，這可能比通過小孔注人花粉懸浮液的效果更好。

注意：在去雄時只摘除雄蕊，若把花萼和花冠同時去掉則會使子房枯萎。在子房兩側(cè)彼此相對的位置上鉆2個小孔，用注射器由1個13離體授粉的方法：①確定開花、花藥開裂、授粉、花粉管進(jìn)入胚珠和受精作用的時間；

②去雄后將花蕾套袋隔離；

為了避免意外授粉，用做母本的花蕾必須在開花之前去雄并套上紙袋。離體授粉的方法：①確定開花、花藥開裂、授粉、花粉管進(jìn)入胚珠和14③采集花粉粒。

為了在無菌條件下采集花粉，把尚未開裂的花藥從花蕾中夾出，置于無菌培養(yǎng)皿中直到花藥開裂。若要從已開放的花中摘取花藥，須將花藥進(jìn)行表面消毒，然后把它們置于無菌培養(yǎng)皿中已滅過菌的濾紙上，直到開裂。③采集花粉粒。為了在無菌條件下采集花粉，把尚未開裂的15④柱頭、胎座或胚珠的處理無菌條件下剝?nèi)∨咧?/p>

開花之后1～2d，將花蕾取下，拿入實驗室準(zhǔn)備進(jìn)行無菌培養(yǎng)。將花萼和花瓣去掉，把雌蕊在70％酒精中漂洗數(shù)秒，以適當(dāng)?shù)臍⒕鷦┻M(jìn)行表面消毒，最后用無菌蒸餾水徹底洗凈，去掉柱頭和花柱，剝?nèi)プ臃勘?，使胚珠暴露出來。④柱頭、胎座或胚珠的處理無菌條件下剝?nèi)∨咧?6

在進(jìn)行離體柱頭授粉的時候，須對雌蕊進(jìn)行仔細(xì)的表面消毒，但不要使消毒液觸及柱頭。在進(jìn)行離體柱頭授粉的時候，須對雌蕊進(jìn)行仔細(xì)的表面消毒17⑤接種

一般就是將這個長著胚珠的整個胎座連同一小段花柄用于胎座授粉，或是把胎座切成兩半或數(shù)塊，每塊帶有若干胚珠，然后以各自的切口和培養(yǎng)基接觸，進(jìn)行培養(yǎng)。

單個胚珠接種在培養(yǎng)基把整個子房接種在培養(yǎng)基⑤接種一般就是將這個長著胚珠的整個胎座連同一小段花柄18⑥授粉

將散出的花粉在無菌條件下按實驗要求授于培養(yǎng)的胚珠、胎座或柱頭上。據(jù)報道，把花粉授在胚珠或胎座上的效果，比撒在胚珠周圍的培養(yǎng)基上效果好。

離體授粉方法成敗的最重要標(biāo)志，是在受精之后能否由胚珠（在胚珠和胎座授粉中）或子房（在柱頭授粉中）形成有生活力的種子。

⑥授粉將散出的花粉在無菌條件下按實驗要求授于培19棗離體授粉及胚珠培養(yǎng)初探郝慧，李登科，金竹萍等材料和方法試驗材料取自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家棗種質(zhì)資源圃．采用前期試驗篩選出的壺瓶棗和晉矮1號兩個性狀優(yōu)良的品種分別作為父母本．棗離體授粉及胚珠培養(yǎng)初探郝慧，李登科，金竹萍等材料和方法20采集尚未開花的花蕾，將其剪成適合操作的小段(盡量保留零級花)，經(jīng)常規(guī)方法消毒以后用無菌水漂洗3次．用鑷子剝?nèi)セㄝ嗪突ü冢仄織椈ǚ圩鞲副?，晉矮一號去雄作母本，離體子房和花藥經(jīng)活化后進(jìn)行人工授粉并接種于培養(yǎng)基上，于(25±1)℃光照條件下培養(yǎng)．培養(yǎng)30d后解剖、觀察，將成活胚珠取出并轉(zhuǎn)接至胚珠培養(yǎng)基上．部分子房作連續(xù)繼代培養(yǎng)．采集尚未開花的花蕾，將其剪成適合操作的小段(盡量保留21園藝植物組織培養(yǎng)第8章ppt課件22不同培養(yǎng)基上子房生長及胚珠成活情況

接種的子房在2d～3d后膨大，顏色由綠轉(zhuǎn)黃，但各培養(yǎng)基上的子房生長情況又有所不同．變化最為明顯的是5號和7號培養(yǎng)基中的材料，體積膨大明顯優(yōu)于其它培養(yǎng)基，且顏色更為鮮亮。不同培養(yǎng)基上子房生長及胚珠成活情況接種的子房在2d23

不同培養(yǎng)基中子房的成活率也有差異，其中在7號培養(yǎng)基中最高，為88.9%，5號培養(yǎng)基次之，為84.9%。繼代培養(yǎng)的子房保持生長約90d以后不再膨大。接種30d后解剖成活并膨大的子房，這時胚珠大多已褐化、枯死，僅有少量存活．成活胚珠為白色，大而透明，其中，有少數(shù)為子房二室三胚珠，未見三個胚珠同時存活情形．不同培養(yǎng)基中子房的成活率也有差異，其中在7號培養(yǎng)基中最24園藝植物組織培養(yǎng)第8章ppt課件25子房愈傷組織化與胚珠成活情況：

接種以后部分子房愈傷組織化．從剝離出的成活胚珠的比例來看，絕大多數(shù)成活胚珠來自愈傷組織化的子房(表3)。子房愈傷組織化與胚珠成活情況：接種以后部分子房愈傷組織26胚珠離體培養(yǎng)：將剝出的離體胚珠接種于固體或液體胚珠培養(yǎng)基中．胚珠存活一段時間以后褐化死亡．胚珠離體培養(yǎng)：27

具體做法是，將柱頭、花柱和子房壁組織全部去掉，使胚珠裸露，將花粉粒直接撒于胚珠之上，然后把胚珠置于人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直到種子成熟。落到胚珠表面上的花粉粒10～15min后萌發(fā)，授粉后1～2d內(nèi)完成受精，5d內(nèi)受精胚珠膨大，鼓脹而不透明，里面已形成了一個4個細(xì)胞的原胚和若干胚乳游離核。22d后，具有兩片子葉的胚即已分化完全。

罌粟的離體胚珠授粉

具體做法是，將柱頭、花柱和子房壁組織全部去掉，使胚288.2胚珠和子房培養(yǎng)

8.2.1胚珠培養(yǎng)

胚珠培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)的一個重要方面，該項技術(shù)最初嘗試于20世紀(jì)30年代，并在蘭科植物獲得成功，20世紀(jì)5O年代以后不斷得以完善并取得重要突破。在觀賞園藝、蔬菜以及果樹等方面均有人進(jìn)行這方面的研究工作，迄今已在葡萄、桃、李、洋蔥、番茄、多花水仙等多種園藝植物上取得成功。8.2胚珠和子房培養(yǎng)8.2.1胚珠培養(yǎng)29

利用胚珠離體培養(yǎng)可以克服遠(yuǎn)緣雜交育種中的胚早期敗育障礙，以及胚珠試管受精克服遠(yuǎn)緣雜交不親合性。利用胚珠離體培養(yǎng)可以克服遠(yuǎn)緣雜交育種中的胚早期敗育障礙30黃瓜受精胚珠離體培養(yǎng)的研究

供試黃瓜品種為津雜二號，87-3，87-6，87-9。人工授粉后分別取4-16日齡的子房為外植體，用自來水沖洗干凈，分別用7O％乙醇消毒3O秒，0.1％HgCl2滅菌1O分鐘，最后無菌水沖洗四次。黃瓜受精胚珠離體培養(yǎng)的研究供試黃瓜品種為津雜二號，831將子房切成內(nèi)含胚珠的薄片，接種于預(yù)培養(yǎng)基上(MS+蔗糖10%+瓊脂0.8%)。約15天左右外植體表面發(fā)白，胚珠凸起，取出胚珠移到1／2MS+蔗糖2％+瓊脂0.8%的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)2O天即生成胚珠試管苗，然后轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基上(MS+蔗糖3%+瓊脂0.8%)。將子房切成內(nèi)含胚珠的薄片，接種于預(yù)培養(yǎng)基上(MS+蔗糖1032

一般經(jīng)過20天左右胚珠苗就可生成為具有正常根、莖、葉的健壯小植株。

生長健壯的試管苗經(jīng)過2天煉苗后分別采用普通移栽法、試管外生根移栽法和T8培養(yǎng)基生根移栽法進(jìn)行移栽，觀察成活率。

培養(yǎng)室溫度25℃-27℃。預(yù)培養(yǎng)和誘導(dǎo)培養(yǎng)階段每日光照16小時，生根壯苗階段每日12小時，光照強(qiáng)度均為3000lx。一般經(jīng)過20天左右胚珠苗就可生成為具有正常根、莖、葉33

Maheshwari等曾由罌粟授粉后6d的離體胚珠中，獲得了有生活力的種子，培養(yǎng)時在這些胚珠中含有的只是合子或2個細(xì)胞的原胚及少數(shù)胚乳核。

Maheshwari等曾由罌粟授粉后6d34

在一種只含有Nitsch(1951）培養(yǎng)基的無機(jī)鹽，White(1943）培養(yǎng)基的維生素、5％蔗糖，而沒有任何生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的相當(dāng)簡單的培養(yǎng)基上，這些胚的生長速度起初雖比在活體條件下慢，但長到球形期以后，生長非常迅速。授粉后26d，這些在培養(yǎng)的胚珠中的胚已長到0.93mm，而同期在活體中的胚最大長度也只有0.65mm。在一種只含有Nitsch(1951）培養(yǎng)基的無機(jī)鹽35

在蔥蓮屬植物中，情況與罌粟屬植物和蘭花不同，當(dāng)把含有一個合子和初生胚乳核的胚珠置于Nitsch培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，胚雖能長到球形期，但不能分化。即使在培養(yǎng)基中添加了生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如激動素、IAA或GA3，也不能促進(jìn)胚的進(jìn)一步生長。然而，若在培養(yǎng)基中加入椰子汁或水解酪蛋白，胚即能正常發(fā)育，種子能在原位萌發(fā)。組氨酸、精氨酸和亮氨酸能完全取代水解酪蛋白的這種促進(jìn)作用。

在培養(yǎng)基中添加激動素或水解酪蛋白能加速這些胚在初期階段的生長。

在蔥蓮屬植物中，情況與罌粟屬植物和蘭花不同，當(dāng)把含有36

在白車軸草（Trifoliumrepens）中，只有在培養(yǎng)基中添加了黃瓜或西瓜幼果（開花后10d）的果汁時，授粉1～2d后處在合子期或雙細(xì)胞原胚期的胚珠，在培養(yǎng)中才能發(fā)育成成熟種子。若加人黃瓜汁后再加GA3(10mg/L)，則能進(jìn)一步促進(jìn)這些非常幼嫩的胚珠發(fā)育成種子。

在白車軸草（Trifoliumrepens）中，只37在離體胚株的發(fā)育中，培養(yǎng)基的滲透壓起著重要的作用，特別是對非常幼嫩的胚珠，其作用格外重要。在矮牽牛中，授粉后7d的胚株處于胚期，若把它們剝離下來，置于含有蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)（蔗糖濃度在4％～10%的范圍內(nèi)高低皆可），它們即能發(fā)育為成熟種子。若胚珠內(nèi)含有的是合子和少數(shù)胚乳核，最適的蔗糖濃度為6％；若緊在受精之后，則為8％。

培養(yǎng)基的滲透壓在離體胚株的發(fā)育中，培養(yǎng)基的滲透壓起著重要的作用，特38

Pontovich和Sveshnikova(1966)觀察到，在罌粟離體胚珠（含有合子或雙細(xì)胞原胚）培養(yǎng)中，即使培養(yǎng)基里補(bǔ)加了水解酪蛋白、椰子汁、腺嘌呤或激動素，胚仍不能進(jìn)行分化。然而，若是培養(yǎng)連在胎座上的胚珠，合子就能發(fā)育成一個正常分化的胚。這就是在離體培養(yǎng)中胎座組織對胚珠生長和發(fā)育的有益影響。

胎座具有類似的促進(jìn)種子發(fā)育的作用

Pontovich和Sveshnikova(39

有些雜種胚在發(fā)育早期即可能夭折，要想在此之前把它們剝離下來進(jìn)行培養(yǎng)，或很麻煩或不可能。在這種情況下，胚珠培養(yǎng)對于獲得雜種就有很大的潛在價值。

有些雜種胚在發(fā)育早期即可能夭折，要想在此之前把它們40

在樹棉（Gossypiumarboreum）×陸地棉（G.hirsutuin）雜交中，雜種胚只能發(fā)育到授粉后8～10d為止，以后則出現(xiàn)大量的異?，F(xiàn)象，使胚不能進(jìn)一步發(fā)育。Beasley(1940)和Weaver(1958)把它們的未成熟胚進(jìn)行培養(yǎng)，以期獲得完整的植株，但離體胚沒能生長。Pundir(1967)在授粉后3d(胚珠內(nèi)含有合子或三細(xì)胞原胚)，把胚珠剝離下來，放在含有50mg/L肌醇的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，5周后胚已充分分化，7周后70～80％的胚珠長成了雜種幼苗。

在樹棉（Gossypiumarboreum）×陸地41

20世紀(jì)50年代末，植物胚胎學(xué)家開始了未授粉胚珠培養(yǎng)的探索，試圖闖出離體誘導(dǎo)單倍體的新途徑，然而未能成功。20世紀(jì)60年代，Tulecke(1964)離體培養(yǎng)未授粉的銀杏雌配子體，得到單倍體愈傷組織，但沒有分化成植株。在被子植物中Nishi和MitSuoka(1969)對水稻未授粉子房培養(yǎng)產(chǎn)生了二倍體和四倍體植株，但未獲得單倍體。20世紀(jì)70～80年代，Uchimiya等(1971)從未傳粉的玉米子房和茄子的胚珠誘導(dǎo)出愈傷組織，并觀察到其中有單倍體細(xì)胞的分裂，表明雌配子體人工誘導(dǎo)單倍體植株是可能的。

20世紀(jì)50年代末，植物胚胎學(xué)家開始了未授粉胚珠培養(yǎng)42

Jenson等進(jìn)行未授粉棉花胚珠培養(yǎng)誘導(dǎo)了極核融合和分裂，但沒有進(jìn)一步的結(jié)果。sanNoeum(1976)首次利用大麥(Hordeumvulgare)為授粉子房培養(yǎng)出單倍體植株。隨后國內(nèi)用未授粉的小麥及煙草子房培育出單倍體植株(祝仲純和吳海觀1979)，以后的報道逐漸增多。經(jīng)統(tǒng)計目前共對20科40余種種子植物未授粉子房或胚珠進(jìn)行過離體培養(yǎng)，成功培養(yǎng)出單倍體植株的植物已達(dá)10個科、25個種及2變種。Jenson等進(jìn)行未授粉棉花胚珠培養(yǎng)誘導(dǎo)了極核43研究較多地集中在禾本科、茄科、百合科、葫蘆科及菊科，占全部再生植株物種的2／3，尤以禾本科的研究最多，占全部種的l／4多。在水稻(周嫦等，1983；Lieta1．，1998)和非洲菊中已分別建立起可重復(fù)的培養(yǎng)流程。研究較多地集中在禾本科、茄科、百合科、葫蘆科及菊科，占全部再44

該項研究成功的意義在于開辟了單倍體育種的另一途徑，這對于花粉培養(yǎng)尚未獲得成功和雄性不育的物種尤為重要。并且為實驗生殖細(xì)胞學(xué)，特別是雌核發(fā)育的研究建立了良好體系。同時為開展植物的遺傳工程提供了新的受體(蔡得田和陳冬玲，1986)。

該項研究成功的意義在于開辟了單倍體育種的另一途徑，這45未受精子房和胚珠培養(yǎng)的技術(shù)因物種不同而有所差異，但包括以下基本技術(shù)程序：（1）選擇合適的基因型材料（2）確定合適的接種時期（胚囊單核期至接近成熟時期的材料）（3）確定合適的培養(yǎng)基（4）采用合適的接種方式（5）保溫培養(yǎng)（6）染色體鑒定（7）染色體加倍（8）胚囊植株及其后代觀察未受精子房和胚珠培養(yǎng)的技術(shù)因物種不同而有所差異，但包括以下基468.2.2子房培養(yǎng)

Nitsch(1951)在一種合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)了小黃瓜、草毒、番茄、煙草和菜豆等的離體子房，從而奠定了子房培養(yǎng)技術(shù)。由已授過粉的花中剝離下來的小黃瓜和番茄的子房發(fā)育成了成熟的果實，里面著生著有生活力的種子。然而，這些果實比自然形成的小。同樣，在離體條件下發(fā)育的摩洛哥柳穿魚（Linariamacroccana）和旱金蓮(Tropaeolummajus)的果實，也不能達(dá)到在自然條件下所能達(dá)到的大小。8.2.2子房培養(yǎng)Nitsch(1951)在一47

Maheshwari和Lal(1958,1961)在屈曲花（Iberisamara）中成功地培養(yǎng)了授粉后1d的離體子房。這個時期的子房含有一個合子和少數(shù)幾個胚乳游離核。在一種含有無機(jī)鹽和蔗糖的簡單培養(yǎng)基上，這些子房生長情況良好，只是胚仍比自然形成的小。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加了B族維生素以后，則獲得了正常大小的果實，它們的樣子可與在自然條件下長成的果實相媲美。若在這種無機(jī)鹽-蔗糖-維生素培養(yǎng)基中再加人IAA，在離體條件下形成的果實甚至能比在活體條件下形成的果實更大一些。Maheshwari和Lal(1958,1961)在48

在蒔蘿和天仙子中，合子期或雙細(xì)胞原胚期的子房在培養(yǎng)中也能正常發(fā)育。在補(bǔ)加了椰子汁的培養(yǎng)基上，蒔蘿子房長成的果實能超過天然果實的大小。在蒔蘿和天仙子中，合子期或雙細(xì)胞原胚期的子房在培養(yǎng)中49離體培養(yǎng)的研究表明，花被的功能不是僅僅充做性器官的保護(hù)結(jié)構(gòu)，在果實和胚胎的發(fā)育中它也起著重要的作用。

在培養(yǎng)普通小麥和斯卑爾脫小麥?zhǔn)诜酆蟛痪玫淖臃繒r，只有小花的花被（內(nèi)外稃）完整無缺，胚才能正常發(fā)育。若把花被去掉，原胚的生長就要受到損害。離體培養(yǎng)的研究表明，花被的功能不是僅僅充做性器官的保50在大麥中LaCroix等（1962）也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，并由此斷定“花被因子”是胚的正常發(fā)育多必需的。當(dāng)不存在這些“花被因子”時，大麥胚的細(xì)胞雖能伸長并合成DNA，但不能分裂。

在雙子葉植物中，去掉花萼也會導(dǎo)致果實發(fā)育不良。因此，當(dāng)在離體條件下進(jìn)行柱頭授粉的時候，保留花冠是十分重要的。在大麥中LaCroix等（1962）也發(fā)現(xiàn)了類似的51

在兩個有性不親合物種油菜和甘藍(lán)的種間雜交中，Inomata(1979)利用子房培養(yǎng)的方法成功地獲得了雜種。在兩個有性不親合物種油菜和甘藍(lán)的種間雜交中，I528.3.1基因型8.3離體授粉中影響結(jié)實的因子

在多種植物培養(yǎng)中，不同基因型在培養(yǎng)中的反應(yīng)不同。非洲菊(Gerberajamsonii)切花型品種間愈傷組織的誘導(dǎo)頻率有很大差異，“Fresultane”為8％、SuperGerbera”12.5％、“K9-8”43.3％；盆栽型17個基因型中有4個不能誘導(dǎo)愈傷組織，7個的誘導(dǎo)率高于3％.8.3.1基因型8.3離體授粉中影響結(jié)實的因子在多538.3.2外植體

在腋花矮牽牛（Petuniaaxillaris）中，離體授粉的胚珠，無論是剝離下來的單個胚珠，還是連在一塊胎座上的一組胚珠，都不能形成有生活力的種子。這是因為花粉粒雖能正常萌發(fā)，但花粉管不能進(jìn)人胚珠。然而，當(dāng)所有胚珠都原封不動地連在完整的胎座上時，授粉后由花粉萌發(fā)直到長出有生活力的種子的整個過程一切正常。8.3.2外植體在腋花矮牽牛（Petuniaaxi54

據(jù)Wagne：和Hess(1973)報道，在矮牽牛中，若是把花柱全部去掉，在胎座授粉之后，對結(jié)實將會產(chǎn)生有害的影響。因而，在進(jìn)行離體授粉的時候，他們培養(yǎng)的是整個雌蕊，為了使胚珠暴露出來，只是剝?nèi)プ臃客獗?。?jù)Wagne：和Hess(1973)報道，在55

在玉米中，連在穗軸組織上的子房比單個子房離體授粉效果好。減少每個外植體上的子房數(shù)目雖然并不影響受精，但對籽粒的發(fā)育會產(chǎn)生有害的影響。只帶有1～2個子房的小塊穗軸不能形成任何發(fā)育充分的籽粒。4個子房一組時，只能形成不大的籽粒;10個子房一組時，其中有1～2個能充分發(fā)育，長成大籽粒。在玉米中，連在穗軸組織上的子房比單個子房離體授粉效果56

在進(jìn)行柱頭授粉的時候，應(yīng)當(dāng)避免弄濕胚珠和柱頭的表面，否則將會影響花粉萌發(fā)，導(dǎo)致花粉管破裂，造成結(jié)實不良。

由雌蕊上剝離胚珠的時間對于離體授粉后的結(jié)實率有明顯影響。在開花后1～2d剝離的胚珠比在開花當(dāng)天剝離的胚珠結(jié)實率較高。玉米果穗進(jìn)行離體授粉的適期是在抽絲后3～4d。在進(jìn)行柱頭授粉的時候，應(yīng)當(dāng)避免弄濕胚珠和柱頭的表面，57

在剝離胚珠或雌蕊時，雌蕊的生理狀態(tài)對離體授粉后的結(jié)實率也有影響。Balatkova等（1977)看到，在煙草中，由曾用本身花粉或蘋果屬植物花粉授過粉的雌蕊上剝離下來的未受精胚珠，比由未授過粉的雌蕊上剝離下來的胚珠，經(jīng)煙草花粉離體授粉后的結(jié)實率高。已知花粉在柱頭上萌發(fā)和花粉管穿越花柱都會影響子房內(nèi)的代謝活動。Deurenberg(1976)等證實，花粉管和花柱之間的互作，能夠刺激子房中蛋白質(zhì)的合成。Balatkova等（1977)在煙草中證實了這項觀察。在剝離胚珠或雌蕊時，雌蕊的生理狀態(tài)對離體授粉后的結(jié)實58

這些結(jié)果表明，在實驗植物的栽培條件下，如果對授粉、花粉管生長、花粉管進(jìn)入子房和雙受精等先后發(fā)生的時間有詳細(xì)的了解，就有可能把剝離胚珠的時間選擇在雌蕊授粉之后和花粉管進(jìn)入子房之前，這樣就會增加離體授粉成功的機(jī)會。在這點上，腋花矮牽牛是個令人感興趣的物種，由于它具有自交不親合性，當(dāng)在同一個雌蕊上同時用本身的花粉進(jìn)行柱頭授粉和胎座授粉時，由后者所導(dǎo)致的受精過程和種子發(fā)育都不受前者的干擾。這些結(jié)果表明，在實驗植物的栽培條件下，如果對授粉、花598.3.3培養(yǎng)基

離體授粉方法涉及到兩個主要過程：①花粉粒的萌發(fā)和花粉管的生長，結(jié)果導(dǎo)致受精；②受精的胚珠發(fā)育為成熟的種子，里面有一個有生活力的胚。這項技術(shù)的效率在很大程度上取決于能夠促成這兩個過程的培養(yǎng)基的成分。8.3.3培養(yǎng)基離體授粉方法涉及到兩個主要過程：①60

要想實現(xiàn)花粉萌發(fā)和花粉管生長并不困難。而且在胎座授粉（這在各種類型的離體授粉方法中是最有前途的一種）中，當(dāng)花粉粒撒落在胚珠上以后，若能在胚珠表面萌發(fā)，花粉管隨即長入胚珠，與培養(yǎng)基并無接觸。若花粉粒不能在胚珠表面萌發(fā)，就需要在一種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上單獨培養(yǎng)花粉粒，然后把花粉管置于胚珠表面。據(jù)Raman等（1980)報道，在玉米中，用已萌發(fā)的花粉進(jìn)行離體授粉之后，可以形成種子。要想實現(xiàn)花粉萌發(fā)和花粉管生長并不困難。而且在胎座授粉61

十字花科植物的三細(xì)胞成熟花粉不易在離體條件下萌發(fā)，因而對這種植物難于進(jìn)行離體授粉。為了在甘藍(lán)中得到有萌發(fā)力的種子，Kameya等（1966）對于離體授粉方法做了一些改變。十字花科植物的三細(xì)胞成熟花粉不易在離體條件下萌發(fā)，因62

他們先把離體胚珠在1%CaCl2溶液中蘸一下以后，再把它們放在一張載玻片上（這張載玻片事先已涂敷了一層厚約40μm的10％明膠溶液），然后立即用由剛開放的花中采集到的花粉進(jìn)行授粉。把載玻片放在培養(yǎng)皿中，用一個里面貼有一片濕濾紙的蓋子蓋上，保存24h之后，把已受精的胚珠轉(zhuǎn)到Nitsch瓊脂培養(yǎng)基上，未受精的胚珠淘汰。通過這個方法，Kameya等由原來75個授過粉的胚珠中，獲得了2個具有萌發(fā)力的種子。若不用CaCl2處理則不能形成種子，可見Ca2+具有刺激花粉萌發(fā)和花粉管生長的作用。他們先把離體胚珠在1%CaCl2溶液中蘸一下以后63

培養(yǎng)基最重要的作用在于促進(jìn)受精胚珠的正常發(fā)育。因此，一項經(jīng)驗之談是，在進(jìn)行離體授粉試驗之前，先要對準(zhǔn)備用做母本植物的幼齡胚珠（含有合子或幾個細(xì)胞的原胚）在培養(yǎng)中所需的最適營養(yǎng)成分和激素組成有所了解。這些知識有助于增加成功幾率。培養(yǎng)基最重要的作用在于促進(jìn)受精胚珠的正常發(fā)育。因此，64確實，在虞美人離體胎座授粉的研究中，Kanta等(1962）所以能最先獲得了有生活力的種子，成功的秘訣就在這里。他們使用的培養(yǎng)基與Maheshwari和Lal(1961)所用的完全相同，但后兩位作者培養(yǎng)成功的是在活體條件下已授粉6d的虞美人胚珠，培養(yǎng)時那些胚珠已經(jīng)受精。確實，在虞美人離體胎座授粉的研究中，Kanta等(1962）65

通常用于離體授粉培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽類，與Nitsch(1951)在進(jìn)行子房培養(yǎng)時所用的無機(jī)鹽類相同，此外再加上蔗糖和維生素（White,1943)。Sladky和Havel(1976）曾試驗過幾種不同的基本培養(yǎng)基，包括White(1943),MS(1962）以及Nitsch(1969）培養(yǎng)基等，但沒有發(fā)現(xiàn)離體授粉子房對它們的反應(yīng)有什么顯著的差異。通常用于離體授粉培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽類，與Nitsch(66

培養(yǎng)基中蔗糖的濃度幾乎都是4％～5％。在玉米中，雖然有些作者使用過濃度高達(dá)15%～17％的蔗糖，但Dhaliwal和King(1978)在正常的5％蔗糖水平上，也由種內(nèi)和種間離體授粉獲得了有生活力的種子。據(jù)Bajaj(1979)報道，7％的蔗糖對玉米最合適。培養(yǎng)基中蔗糖的濃度幾乎都是4％～5％。在玉米中，雖67

關(guān)于各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他補(bǔ)加物對胚珠培養(yǎng)中種子發(fā)育的效果，資料十分貧乏。這可能就是不能形成種子的原因，尤其是當(dāng)在離體條件下花粉萌發(fā)、花粉管長人胚珠和受精作用