專題5-DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件

專題五DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)

課題1DNA的粗提取與鑒定

課題2多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片斷

課題3血紅蛋白的提取和分離專題五DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)

課題1DNA的粗提取與鑒定

1課題1DNA的粗提取與鑒定

課題12一、提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路（1）選用一定的________或________方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。（2）

DNA的粗提取就是利用DNA與______、______和________等在物理或化學性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。物理化學RNA蛋白質(zhì)脂質(zhì)一、提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路物理化學RN3（1）利用DNA的溶解性 DNA的溶解度2、提取DNA分子的基本原理（1）利用DNA的溶解性2、提取DNA分子的基本原理4

DNA不_______酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質(zhì)則_______酒精。利用這一原理，可將DNA與蛋白質(zhì)進一步分離。溶于溶于 溶于溶于5①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但對________沒有影響。②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受____________的高溫，而

DNA在80℃以上才會變性。③洗滌劑能夠瓦解__________，但對________沒有影響。溫度洗滌劑DNA60-80℃細胞膜DNA（2）利用DNA和蛋白質(zhì)對酶、_______和________的耐受性不同溫度洗滌劑DNA60-80℃細胞膜DNA（2）利用DNA和蛋6（3）DNA的鑒定：

DNA在沸水浴的條件下，遇________反應(yīng)會呈現(xiàn)________二苯胺藍色（3）DNA的鑒定：二苯胺藍色7二、DNA的粗提取與鑒定的實驗設(shè)計（一）實驗材料的選取

材料：新鮮的雞血注意：本實驗中，要往雞血中加入抗凝劑（檸檬酸鈉溶液）

原則上只要含DNA的生物材料都可以，但是選取DNA含量相對較高的生物組織，成功率更大。二、DNA的粗提取與鑒定的實驗設(shè)計（一）實驗材料的選取材料8(1)先將新鮮的雞血離心，獲得雞血細胞(2)在雞血細胞中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液1、破碎細胞討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？利用了什么原理？2、過濾，獲取含DNA的濾液(1)先將新鮮的雞血離心，獲得雞血細胞（二）破碎細胞，獲取含9（三）去除濾液中的雜質(zhì)討論：為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)

答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)（三）去除濾液中的雜質(zhì)討論：為什么反復地溶解與析出DNA，能10討論：方案二與方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離

方案二利用了酶的專一性；方案三利用了DNA的穩(wěn)定性。討論：方案二與方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解11（四）

DNA的析出與鑒定DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液（體積分數(shù)為95％），靜置2-3min，溶液中會出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水1、DNA的析出（四）DNA的析出與鑒定DNA的析出用的是與濾液體12A:2mol/L的NaCl溶液5ml+DNA絲狀物+

二苯胺試劑4ml

B:2mol/L的NaCl溶液5ml

+二苯胺試劑4ml混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否有藍色2、DNA的鑒定A:2mol/L的NaCl溶液5ml+DNA絲狀物+13以雞血為實驗材料進行DNA的粗提取②雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時較長1、雞血細胞做實驗材料的原因①雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得以雞血為實驗材料進行DNA的粗提取②雞血細胞極易吸水脹破，而142、實驗原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14mol／L時,DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水浴）會染成藍色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。2、實驗原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaC15實驗材料和用具實驗材料：1、雞血細胞液（5~10ml）；2、體積分數(shù)為95%的冷酒精溶液（實驗前置于冰箱內(nèi)冷卻24h）；3、蒸餾水；4、質(zhì)量濃度為0.1g/ml的檸檬酸鈉溶液（抗凝劑）5、物質(zhì)的量濃度分別為2mol/L和0．015mol/L的NaCl溶液；6、二苯胺試劑實驗材料和用具實驗材料：16專題5--DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件17答：因為DNA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物可以析出,懸浮于溶液中討論：（2）觀察絲狀物呈什么顏色？答：白色（1）為什么要加50mL的冷酒精？答：因為DNA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含18答：有絲狀物的試管變成藍色，另一試管還是原來顏色（4）這一鑒定結(jié)果說明什么問題？（3）比較兩個試管中溶液的顏色有什么不同？答：提取出的絲狀物是DNA（5）DNA的直徑約為20×10-10m，實驗中出現(xiàn)的絲狀物的粗細是否表示1個DNA分子直徑的大小？答：DNA分子直徑只有2nm。絲狀物是多個DNA子聚在一起形成的答：有絲狀物的試管變成藍色，另一試管還是原來顏色（4）這一鑒19答：整個實驗共“兩次蒸餾水，三次過濾，六次攪拌”總結(jié)：①兩次蒸餾水第一次：使雞血細胞吸水脹破，提取核DNA

第二次：稀釋NaCl溶液，使DNA黏稠物析出（1）此實驗過程中有幾次使用蒸餾水？幾次過濾，幾次攪拌？答：整個實驗共“兩次蒸餾水，三次過濾，六次攪拌”總結(jié)：①兩次20②三次過濾第一次：過濾核外物質(zhì)，除去不溶的雜質(zhì)第二次：過濾除DNA的其他核內(nèi)物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)

第三次：過濾含DNA的NaCl溶液，得到濾液

②三次過濾第一次：過濾核外物質(zhì)，除去不溶的雜質(zhì)21六次攪拌：攪拌目的第一次

攪拌加蒸餾水的雞血細胞液，加速細胞破裂第二次

攪拌含DNA的高濃度鹽溶液，加速

_______________________第三次

攪拌加蒸餾水的NaCl溶液，

____________________________第四次

攪拌含DNA的高濃度鹽溶液，加速

_______________________第五次

攪拌含DNA的酒精溶液，提取

__________________________第六次

攪拌含DNA白色絲狀物的鹽溶液，加速

__________________DNA的溶解均勻稀釋以析出更多DNADNA的溶解含雜質(zhì)較少的DNADNA的溶解六次攪拌：攪拌目的第一次攪拌加蒸餾水的雞血細胞液，加速22

觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍色說明實驗基本成功，如果不呈現(xiàn)藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現(xiàn)錯誤，需要重新制備四、課題成果評價（一）是否提取出了DNA觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DN23

本實驗提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)（二）分析DNA中的雜質(zhì)本實驗提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等24課題2多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片斷課題225DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2263.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)（1）DNA分子是由

的（脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。（2）

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。（3）兩條鏈上的堿基通過

連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對，

一定同胞嘧啶配對。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤3.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)（1）DNA分子是由274.DNA的復制b.時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期。c.場所細胞核（主要）、線粒體、葉綠體。a.概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程。d.基本條件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈4.DNA的復制b.時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期。28參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結(jié)：胞內(nèi)DNA復制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸29一、PCR技術(shù)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。一、PCR技術(shù)30（1）3′端和5′端：為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基（—OH）末端稱為________，而含____________的末端稱為________；一個雙鏈DNA分子中含兩個3′端和兩個5′端，如果一條鏈的方向是________，則另一條鏈的方向就是________，這就是反向平行的含義。3’端5’端磷酸基團5’→3’3’→5’1、PCR擴增方向3’端5’端磷酸基團5’→3’3’→5’1、PCR擴增方向31（2）DNA分子中相鄰兩個脫氧核苷酸殘基通過________________相連，該化學鍵是由一分子脫氧核苷酸中3號碳原子上的羥基（—OH），與相鄰的另一分子脫氧核苷酸中5號碳原子上的磷酸基團脫水聚合而成。所以DNA的合成方向總是從子鏈的________向________延伸。3’5’磷酸二酯鍵5’端3’端（2）3’5’磷酸二酯鍵5’端3’端32專題5--DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件332、PCR技術(shù)原理（1）PCR：DNA分子在一定條件下可以進行________復制。（2）DNA的熱變性原理：在________的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為________；當溫度緩慢下降后，兩條被分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈，這個過程稱為________。體外80-100℃變性復性2、PCR技術(shù)原理（2）DNA的熱變性原理：體外80-10034二、PCR的反應(yīng)過程DNA模板與模板DNA兩條鏈相結(jié)合的兩種引物1、反應(yīng)條件穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境四種脫氧核苷酸耐熱的DNA聚合酶嚴格控制溫度變化的控溫設(shè)備二、PCR的反應(yīng)過程DNA模板與模板DNA兩條鏈相結(jié)合的兩種35靶序列靶序列第一步：變性（90-95℃）2、反應(yīng)過程靶序列靶序列第一步：變性（90-95℃）2、反應(yīng)過程36靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’第二步：復性（50℃左右）靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’37靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶第三步：延伸（72℃左右）靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’Ta38靶序列

靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個DNA分子靶序列靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個DNA分子393、結(jié)果（P60頁圖5-9復制結(jié)果）（1）PCR的每一輪循環(huán)包括變性、復性和延伸三步，從第二輪循環(huán)開始，每次循環(huán)的產(chǎn)物也做模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸。這樣，DNA聚合酶只能特異地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的DNA序列呈____________。指數(shù)擴增3、結(jié)果（P60頁圖5-9復制結(jié)果）（1）PCR的每一輪循環(huán)40（2）PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，處于兩引物間固定長度的序列數(shù)目約為________。230（2）PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，處于兩引物間固定長度的序411、PCR儀（一）.設(shè)備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。三、PCR的實驗操作1、PCR儀（一）.設(shè)備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀422、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液431.準備2.移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上。用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑?；旌虾笊w嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。3.混合（1）過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。4.離心（2）離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。1.準備2.移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將44將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。5.反應(yīng)循環(huán)數(shù)變性復性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復性和延伸.將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。5.反應(yīng)循45PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6.注意事項（1）隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；（2）分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾46（一）、理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1.一條DNA，復制n次，DNA為2n2.a條DNA，復制n次，DNA為a×2n（二）、實驗中DNA含量的測定1.原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2.過程（1）稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋.（一）、理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1.一條D47以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值DNA含量(g)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)50：在標準厚度為1cm比色杯中，OD260為1相當于50g/mL的雙鏈DNA分子（2）對照調(diào)零（3）計算（4）計算以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的48光吸收波長／nm2602402202800.10.2光吸收波長／nm2602402202800.10.249比色杯比色杯50課題3血紅蛋白的提取和分離課題351一、分離蛋白質(zhì)的基本方法原理1、凝膠色譜法（分配色譜法）：a.凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）

b.概念：根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用來進行分離。

一、分離蛋白質(zhì)的基本方法原理1、凝膠色譜法（分配色譜法）：52相對分子質(zhì)量直徑大小運動方式運動速度運動路程洗脫次序大____凝膠顆?？障吨睆剑慌抛柙赺___垂直向下移動____較短先從凝膠柱洗脫出來小____凝膠顆?？障吨睆剑梢赃M入顆粒內(nèi)部垂直向下移動，無規(guī)則擴散進入凝膠顆粒____較長后從凝膠柱洗脫出來大于凝膠外部快小于慢相對分子質(zhì)量直徑大小運動方式運動速度運動路程洗脫大____凝53專題5--DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件54洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子混合物上柱洗脫大分子流動快收集收集混合物洗552、

緩沖溶液的作用和組成：

（1）作用：能夠抵制____________的對溶液___

的影響，維持pH基本不變。外界的酸或堿pH值(2)緩沖溶液的配制

通常由_______種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的_________就可以制得______________

使用的緩沖液。1--2比例在不同pH范圍內(nèi)2、緩沖溶液的作用和組成：（1）作用：能夠抵制____56思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的pH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察紅色和材料的科學研究活性。思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么57在同一電場下，由于各種分子帶電性質(zhì)（正電荷或負電荷）的差異及分子本身大小、形狀的不同，而使帶電粒子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。（2）原理：（1）概念：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程3、電泳：在同一電場下，由于各種分子帶電性質(zhì)（正電荷或負電荷）的差異及58（3）常見方法瓊脂糖凝膠電泳聚丙稀酰胺凝膠電泳（3）常見方法瓊脂糖凝膠電泳59二、粗提取血紅蛋白蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：血液血漿血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白兩個a－肽鏈兩個β一肽鏈樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定二、粗提取血紅蛋白蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：血液血漿60專題5--DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件61(1)目的：去除__________1、紅細胞的洗滌雜質(zhì)蛋白(2)方法：采集血樣：為防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血劑檸檬酸鈉

低速短時間離心：500r/min，離心2min，這樣做的目的是防止紅細胞與白細胞一同沉淀，達不到分離效果

吸去血漿：用膠頭吸管吸去上層黃色血漿

：直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已經(jīng)洗滌干凈，否則需重復洗滌(1)目的：去除__________1、紅細胞的洗滌雜質(zhì)蛋白62

④生理鹽水洗滌：向盛有暗紅色紅細胞液體的燒杯中加入五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌10min

⑤低速短時間離心

⑥重復③④步驟3次：直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已經(jīng)洗滌干凈，否則需重復洗滌⑤低速短時間離心63（1）方法：加_________到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘。（2）目的：使紅細胞吸水____，血紅蛋白釋放出來。漲破蒸餾水2、血紅蛋白的釋放（3）原理：滲透作用（1）方法：加_________到原血液體積，再加40％體643、分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:3、分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以20065第1層無色透明甲苯層第2層脂溶性物質(zhì)沉淀層，白色薄層固體第3層

紅色透明液體（血紅蛋白水溶液）

第4層其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀第1層無色透明甲苯層第2層脂溶性物質(zhì)沉淀層，白色薄層664、透析(1)原理：______能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內(nèi)。(2)過程：取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的