食用菌栽培技術基礎性實驗詳解

植物生產國家級實驗教學示范中心《食用菌栽培技術基礎性實驗》實驗項目序號實驗項目名稱建議學時數(shù)每組人數(shù)必選/可選1食用菌形態(tài)結構的觀察22必選2胃種培養(yǎng)基的配制23必選3高壓蒸汽滅菌124必選4胃種的轉管及分離技術21必選5主要病蟲害的識別23必選實驗一、食用菌形態(tài)結構的觀察常見與栽培的食用菌主要是擔子菌亞門層菌綱和腹綱的一些種類，它們由雙核菌絲分化形成子實體，子實體是有性匏子著生的器官其孢子外生在擔子上，并聚集成一層子實層，但它們的子實體（擔子實）形狀因種類不同而有很大差別，故為我們認識食用菌類別的主要標志之一。一、 目的要求使學生能找出食用菌次生菌絲的特征，分辨?zhèn)憔奈⒂^構造；熟練制作標本片，能在顯微鏡下快速找出目標；并能分析圖像不清的原因或排除顯微鏡的某些故障。二、 儀器用品及實驗材料器具：光學顯微鏡、尖頭鑷子、解剖刀、解剖針、解剖剪、刀片、載玻片、蓋玻片、酒精燈、火柴、蕃紅染色劑、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。材料：平菇、草菇、香菇、蘑菇、金針菇等食用菌的斜面菌種與平板菌落，及其各種鮮子實體，胡蘿卜。三、 實驗內容與方法（一） 實驗內容次生菌絲體的觀察（菌苔形態(tài)及微觀形態(tài)的觀察）子實體的觀察（外觀形態(tài)及菌褶微觀構造的觀察）（二） 方法步驟1、次生菌絲體的觀察（1）肉眼觀察從顏色、菌絲生長勢、爬壁力、有無無性匏子、菌苔邊緣特征等方面進行識別。（2）顯微鏡觀察制片：在載玻片中央滴蕃紅，用無菌接種針撥去氣生菌絲，取其下綠豆粒大一薄片培養(yǎng)基置于蕃紅染液中。放蓋片，顛吸水紙后用手指適當按壓，將培養(yǎng)基壓碎，使其均勻平展于載玻片上。鏡檢：將標本片固定于載物臺上，低倍鏡下找理想目標，高倍鏡下觀察菌絲的分支、分隔、鎖狀聯(lián)合等特征。2.子實體的觀察（1）肉眼觀察先觀察完整子實體，從顏色、大小、及其菌蓋、菌褶、菌柄、菌環(huán)、菌托等特征將各菌類的子實體進行比較識別。用解剖刀縱切子實體，觀察菌蓋和菌柄等部分的組成。從菌肉顏色、質地、菌褶著生情況；菌柄的質地、粗細、是否中實等方面進行比較。（2）微觀觀察切片：用尖頭鑷子取一小塊菌褶，將其夾于胡蘿卜條的切線中間，用刀片橫切，切下的切片放入有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，切片要求薄而均勻。制片：載玻片中央滴蒸餾水，用解剖針挑取最薄的切片放于載片水滴中，放蓋片。鏡檢：將標本片固定于載物臺上，用低倍鏡找理想目標，再用高倍鏡觀察子實層、擔子和擔匏子的形態(tài)、大小及排列狀況。表格總結平菇、蘑菇、草菇、金針菇、香菇等子實體各部分的宏觀特征出次生菌絲、擔子、擔匏子及子實層的圖像實驗二、母種培養(yǎng)基的配制胃種是菌種生產的關鍵，要求純度高，不能混生雜菌，同時胃種的菌絲體較為纖細，分解培養(yǎng)料的能力較弱。因此，胃種菌絲體需要培養(yǎng)在營養(yǎng)豐富，易被吸收，表面光滑易于鑒別有無雜菌感染的瓊脂培養(yǎng)基上。一、目的要求掌握固化培養(yǎng)基的配制，學會棉塞的制作方法。分析有天然原料與無天然原料培養(yǎng)基在配制過程中的不同。二、儀器用品及實驗材料器具：天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、漏斗架、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、棉花、線繩、牛皮紙、皮筋、紗布、電爐、菜刀、菜板、小鋁鍋等。材料：馬鈴薯、葡萄糖或蔗糖、麩皮、瓊脂、水。三、實驗內容與方法（一） 實驗內容制馬鈴薯濾液融化瓊脂培養(yǎng)基的分裝棉塞的制作（二） 方法步驟配方（PDA）馬鈴薯200g，葡萄糖20g,瓊脂15~20g，自來水1000ml,pH自然。制作方法（1） 制濾液 馬鈴薯刮去粗皮，去芽眼，切成碎塊，稱量后放鍋中，加水1200~1300ml,將其煮沸20min。用雙層紗布過濾，取1000ml濾液。（2） 化瓊脂 將濾液加熱至即將沸騰時加入瓊脂，不斷攪拌（控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦）。瓊脂完全融化后加入剩余原料，并使其溶解（用熱水補足水量）。（3） 分裝 通過漏斗裝置，趁熱將培養(yǎng)基分裝于試管中，裝量約占試管高度的1/4（分裝三角瓶，其裝量以不超過其容積的一半為宜）。管口或瓶口不要沾染培養(yǎng)基。（4） 制棉塞棉花以白色長絨的不脫脂棉花為宜。根據(jù)試管□大小取棉花，將其卷成棉塞，最好外包一層紗布。將棉塞塞入試管口。棉塞長度約6~7cm,塞入試管2/3。要求外表光滑，外包的紗布無皺折，松緊適宜等。A.正確；B.不正確包扎 管口堵入棉塞后7或9支試管扎一捆，棉塞部分用牛皮紙包扎。在包裝紙上標明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。四、思考題與實驗報告制取胃種培養(yǎng)基時，配方中的天然原料應怎樣處理？何時加入瓊脂？融化時注意什么問題？分裝的技術要求有哪些？棉塞的作用和技術要求有哪些？菌種培養(yǎng)時管口堵膠塞或軟木塞行嗎？為什么？實驗三、高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽消毒和常壓蒸汽消毒統(tǒng)稱濕熱滅菌。通過飽和蒸汽殺死物體上和介質中的全部病原微生物及其匏子和芽匏。濕熱滅菌的飽和蒸汽具有很強的穿透力，可以破壞病原微生物及其孢子和芽匏的核酸、使蛋白質變性凝固、酶失去活性。一、 目的要求了解高壓鍋的構造及其功能，能獨立完成各環(huán)節(jié)的操作。并能解釋安全閥自動打開或滅菌不徹底的原因。二、 儀器用品及實驗材料

材料 培養(yǎng)基器具高壓鍋，1cm粗的木棍三、實驗內容與方法（一） 實驗內容高壓鍋的構造高壓鍋的使用斜面培養(yǎng)基的擺制滅菌效果的檢驗（二） 方法步驟高壓鍋的構造'外鍋:裝水

內鍋:裝物「壓力表鍋蓋排氣閥安全閥'外鍋:裝水

內鍋:裝物「壓力表鍋蓋排氣閥安全閥高壓鍋的使用'裝鍋外鍋裝熱水WOCiTCiCiCiml（手提式）,物品疏松放入內鍋，緊固鍋蓋。排氣：加熱，打開排氣閥，待冒熱氣3~5mm是將其關閉.使用＜升壓：使壓力針升Mlkg/cm2（0.1MpaJ2fC）保壓滅菌：調解熱源，維持此壓25~30mm.、降壓出鍋：關閉熱源，自然降壓至零.略開鍋蓋，溫度約60C時取出培養(yǎng)基.斜面與平板培養(yǎng)基的制作 將試管培養(yǎng)基趁熱斜置于木棍條上，傾斜度以培養(yǎng)基約占管長的1/2為宜，不要使其滾動。若溫度低可蓋毛巾，以免形成過多的冷凝水。趁熱將三角瓶中的培養(yǎng)基以無菌操作法注入無菌培養(yǎng)皿中，每皿的裝量15~20ml（剛覆蓋皿底）。滅菌效果的檢驗 將凝固的斜面培養(yǎng)基放入37C溫箱培養(yǎng)2~3天，若光滑無雜菌生長，即可待用。四、思考題與實驗報告圖解說明培養(yǎng)基的配制過程，并指明要點。排除冷空氣的時機、目的及方法是什么？保壓的時機與方法是什么？滅菌時間從何時算起？擺制斜面的時機與方法是什么？導致滅菌后的培養(yǎng)基長有雜菌的原因有哪些？該怎樣處理？滅菌在微生物實驗操作中有何重要意義？實驗四、母種的轉管及分離技術將胃種移入新斜面培養(yǎng)基上的過程，稱為轉管。是一項重要的常規(guī)操作，常用的工具是接種環(huán)。無論引進或自己分離的胃種，都需要適當傳代，使之產生大量再生胃種，才能源源不斷供應生產。將子實體、菌核、菌索等一小塊組織放于斜面培養(yǎng)基上，使其萌發(fā)為純菌絲的方法，稱為組織分離。該法具有簡便、易成功、能保持原菌種性狀等優(yōu)點，但重復多易退化，應與孢子分離交替進行。組織分離法適用于絕大多數(shù)食用菌（膠質的耳類食用菌除外）。一、 目的要求清楚無菌操作要點，熟練操作胃種轉管、多匏分離及組織分離技術。能正確分析自己的接種結果。二、 儀器用品及實驗材料材料 空白斜面培養(yǎng)基、平菇胃種、平菇子實體等器具 酒精燈、接種環(huán)、火柴、尖頭鑷、酒精棉球、大鑷子、接種箱、超凈工作臺、高錳酸鉀、37%甲醛溶液、紫外燈、2%來蘇水、標簽紙等。三、實驗內容與方法（一）實驗內容接種環(huán)境的處理胃種的轉管組織分離多匏分離(二)方法步驟接種環(huán)境的處理接種箱的熏蒸先用2%來蘇清潔接種箱內外，放入接種所需的物品，用甲醛熏蒸。每立方米空間一般用甲醛10ml，加半量高錳酸鉀(5~7g)使甲醛氧化揮發(fā)。先將高錳酸鉀放入接種箱內的容器中，再注入甲醛，立即產生強烈刺激的甲醛氣體。熏蒸時間至少保持30min以上。超凈工作臺的消毒 用消毒液擦拭臺面后放置接種所需物品，開啟超凈工作臺上的紫外燈，照射20min后使用。母種的轉管手及菌種管的消毒用肥皂洗手，再用75%酒精棉球擦手和菌種管表面，在酒精燈焰上略燒試管外的棉塞后，立即將菌種管放入接種箱內。轉管兩手從接種孔伸入接種箱內，酒精棉球擦拭接種環(huán)。左手持菌種管和斜面管，兩支試管口對齊于火焰上方。右手持接種環(huán)，并將其在燈焰上干熱滅菌，用小指及無名指拔掉棉塞，使棉塞底部朝外。接種環(huán)冷卻后伸入菌種管內取略豆粒大帶有培養(yǎng)基的菌種塊，迅速移入斜面培養(yǎng)基的中部，菌絲朝上。然后，將棉塞在火焰上燒一下，立即塞入試管口，旋緊棉塞。接種環(huán)不要觸碰管口及管壁。接種后的試管應立即貼標簽，注明菌種名稱及接種日期，再進行適溫培養(yǎng)。組織分離法此法是生產中最常用的方法，具有操作簡便，菌絲萌發(fā)快，分離所得的菌種在培養(yǎng)基條件適宜的情況下，能保持原菌種的優(yōu)良性狀。種菇消毒 在接種箱內，用鑷子夾著燃燒的酒精棉球迅速擦拭菇體。取接組織將菇體撕開，用無菌尖頭鑷在柄蓋交界處取綠豆粒大組織，放入斜面培養(yǎng)基上。迅速塞上棉塞。多孢子分離鉤懸法是一種特別適用于耳類，也適用于傘菌類的多匏分離法。在接種箱內將一小塊消毒的耳片或菇片懸掛于無菌三角瓶內(裝約1cm厚的培養(yǎng)基)，在25C左右條件下，約24h現(xiàn)匏子粉時以無菌操作法取出分離材料。適溫培養(yǎng)后挑取健壯尖端菌絲轉管。匏子￡印分離法取成熟子實體經表面消毒后，切去菌柄，將菌褶向下放置于滅過菌的有色紙上，在20—24C靜置一天，大量孢子落下形成匏子￡印接種環(huán)沾少量匏子在試管培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。母種的培養(yǎng)將斜面朝下斜置疊放于瓷盤中，放于培養(yǎng)箱中適溫培養(yǎng)。2一3天后每天都要檢查菌絲生長情況。及時挑揀污染試管（出現(xiàn)粘膜或雜色）。注意事項（1） 純化菌絲長至斜面1/2時，挑尖絲轉管，培養(yǎng)成再生胃種。（2） 出菇試驗將再生胃種擴成原種、栽培種，使其出菇?？串a量、質量、形態(tài)、長勢、抗性如何，鑒定為優(yōu)質菌種后，才可供生產使用。（3） 控制菌齡菌絲即將長滿斜面（一般7一10天）終止培養(yǎng)。分別用于菌種保藏或繁衍原種。四、思考題與實驗報告評比接種結果。分析自己接種成敗的原因。孢子分離的胃種為何一定要做出菇試驗？4..試設計一個分離野生平菇菌種的實驗方案。實驗五、食用菌主要病蟲害的識別食用菌所需的生態(tài)條件與生活條件同樣有利于病蟲害的滋生。若不采取必要的預防措施，不重視生態(tài)環(huán)境的控制，雜菌與害蟲就會大量發(fā)生，對生產造成極大損失。隨著食用菌生產迅速發(fā)展，由于多品種的周年性生產，以及作坊式簡陋的生產方式，缺乏配套性病蟲防治措施，使病菌、害蟲種類日趨增多，危害加重，病蟲害已成為食用菌高產、穩(wěn)產的重要限制因素。掌握病蟲害發(fā)生規(guī)律，使用有效防治方法，是食用菌生產中的重要管理內容。一、 目的要求正確識別病蟲害的形態(tài)特征及侵染癥狀，分析產生的原因，能采取正確的防治方法。二、 儀器用品及實驗材料材料:被侵染的培養(yǎng)料和子實體器具:放大鏡、顯微鏡、解剖鏡、接種針、尖頭鑷、載玻片、蓋玻片、吸水紙、酒精燈、火柴、無菌水、染色劑等。三、 實驗內容與方法（一）實驗內容競爭性真菌侵染癥狀的識別真菌病害的識別主要蟲害的識別（二）方法步驟競爭性真菌侵染癥狀的識別夕卜觀:用肉眼和放大鏡觀察根霉、毛霉、青霉、木霉、曲霉、鏈匏霉等競爭性雜菌的危害癥狀鏡檢:載玻片中央滴半滴無菌水或染色劑，無菌尖頭鑷取少許污染材料置于水或染液中，無菌接種針輕輕撥散，放蓋片。低倍鏡找理想目標，高倍鏡下觀察各霉菌的形態(tài)特征。真菌病害的識別外觀用肉眼和放大鏡觀察褐腐、褐斑、軟腐病的危害癥狀。鏡檢載玻片中央滴半滴無菌水或染色劑，無菌尖頭鑷取少許病部組織置于水或染液中，無菌接種針輕輕撥散，放蓋片。低倍鏡找理想目標，高倍鏡下觀察各霉菌的形態(tài)特征。