第十五章：酵母菌基因工程選編課件

第十五章酵母菌基因工程酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物。共有56屬和500多個種組成。酵母是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。第一節(jié)簡介發(fā)展歷程1974，Rlarck-walker和Miklos發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)酵母中存在質(zhì)粒。1978，Hmnen將來自一株釀酒酵母的leu2基因?qū)肓硪恢赆劸平湍?，彌補了后者的Leu2缺陷，標(biāo)志著酵母表達(dá)系統(tǒng)的建立。1981，Hinnen等用酵母基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了人干擾素。1983，我國首次用酵母菌表達(dá)了乙型肝炎病毒表面抗原基因。1996，完成了第一個真核生物——釀酒酵母全基因組的測序。酵母菌是外源基因最成功的真核生物表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢在于：安全無毒，不致??；有較清楚的遺傳背景，容易進行遺傳操作；易進行載體DNA的導(dǎo)入。DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷發(fā)展優(yōu)化，多數(shù)酵母菌可以取得較高的轉(zhuǎn)化率；培養(yǎng)條件簡單，容易進行高密度發(fā)酵；能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中；有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能。缺陷在于：表達(dá)效率相對低；酵母常有密碼子偏愛性，真核基因在其中表達(dá)時需要人工修正。酵母基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀目前酵母基因工程中發(fā)展和應(yīng)用較多有釀酒酵母、乳酸克魯維酵母等，其應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下兩方面：釀酒酵母的自身改造：將葡萄糖淀粉酶基因?qū)脶劸平湍福勺陨矸置谄咸烟堑矸勖福?。將外源的蛋白水解酶基因?qū)脶劸平湍福勺陨矸置诘鞍姿饷福ⅵ?葡聚糖酶基因?qū)脶劸平湍福捎行Ы到恹溠恐械摩?葡聚糖，改善啤酒的過濾效率）將ATP硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶在釀酒酵母體內(nèi)表達(dá)（促進SO2的生成，維持啤酒風(fēng)味的穩(wěn)定）將人血清清蛋白（HAS）基因轉(zhuǎn)化到釀酒酵母（生產(chǎn)出富含HAS的啤酒新品種）酵母表達(dá)異源蛋白表達(dá)水平:酵母表達(dá)系統(tǒng)主要用于表達(dá)外源基因，表達(dá)水平的高低直接關(guān)系到其應(yīng)用價值。酵母的高效表達(dá)從三方面實現(xiàn)：通過開發(fā)高效的啟動子提高和控制外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。提高表達(dá)載體在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。通過多次同源重組以及rDNA介導(dǎo)的整合兩種方式提高表達(dá)基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù)。表達(dá)質(zhì)量：除表達(dá)水平外，外源基因表達(dá)質(zhì)量的好壞也直接關(guān)系到酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用價值。酵母基因工程的發(fā)展趨勢解決酵母基因工程中還存在的缺陷；在人類基因組計劃中的應(yīng)用研究是一個重要的發(fā)展方向；利用酵母基因工程篩選更多的制藥；改造釀酒酵母自身，降低生產(chǎn)酒精的成本；酵母的生理承受極限研究將引起人們的關(guān)注。廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌提高重組異源蛋白產(chǎn)率的誘變宿主菌抑制超糖基化作用的突變宿主菌減少泛蛋白因子依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌內(nèi)源性蛋白酶缺陷型的突變受體菌第二節(jié)、酵母菌的宿主系統(tǒng)廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達(dá)的研究的酵母菌包括：其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想

屬名舉例酵母屬釀酒酵母克魯維酵母屬乳酸克魯維酵母畢赤酵母屬巴斯德畢赤酵母裂殖酵母屬非洲酒裂殖酵母漢遜酵母屬多態(tài)漢遜酵母提高重組異源蛋白產(chǎn)率的誘變宿主菌使啤酒酵母中異源蛋白產(chǎn)量提高和質(zhì)量改善的突變利用經(jīng)典誘變技術(shù)篩選分離釀酒酵母的核突變株或細(xì)胞質(zhì)突變株，可以提高重組異源蛋白在酵母菌中的合成產(chǎn)率。然而，有些在表型上能提高某種特定異源蛋白表達(dá)的突變株未必具有促進其它外源基因表達(dá)的能力，因為提高一種特定異源蛋白合成和分泌的影響因素極其復(fù)雜，其中包括表達(dá)產(chǎn)物本身的生物化學(xué)和生物物理特性，只有那些能促進任何外源基因分泌表達(dá)的基因型穩(wěn)定突變株，才能用作理想的基因工程受體細(xì)胞。許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團，常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。抑制超糖基化作用的突變宿主菌酵母菌普遍擁有完整的糖基化系統(tǒng)，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的天門冬酰胺側(cè)鏈糖基修飾和加工系統(tǒng)對來自高等動物和人的異源蛋白活性表達(dá)是極為有利的，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。突變類型生物效應(yīng)mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷och外側(cè)糖鏈添加缺陷型這些突變菌株不能在異源蛋白的天門冬酰胺側(cè)鏈上延長甘露多聚糖長鏈，這是釀酒酵母超糖基化的一種主要形式。含有mnn9突變的酵母菌細(xì)胞缺少能聚合外側(cè)糖鏈的a-1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性，而och1突變株則不能產(chǎn)生膜結(jié)合型的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。盡管其它類型的突變株尚未進行有效的鑒定，但它們卻能使異源蛋白在天門冬酰胺側(cè)鏈上進行有限度的糖基化作用，基本上杜絕了糖基外鏈無節(jié)制延長的超糖基化副反應(yīng)。減少泛蛋白因子依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用第一類基因含有多個泛蛋白因子編碼重復(fù)序列，各重復(fù)序列頭尾相連形成多拷貝結(jié)構(gòu)；酵母菌的泛蛋白因子編碼基因分為兩大類：第二類基因為單一泛蛋白因子編碼序列與另一個不相關(guān)的多肽編碼序列的融合基因，后者稱為羧基延伸蛋白（CEP），它也有兩種大小不同的序列，其中CEP52由52個氨基酸殘基組成，而CEP76-80則由76-80個氨基酸殘基組成。在酵母菌中共有四個基因編碼泛蛋白因子：UBI1和UBI2編碼融合蛋白泛蛋白-CEP52UBI3編碼泛蛋白-CEP76UBI4則編碼一個五聚體泛蛋白因子UBI1、UBI2和UBI3基因均能在酵母菌對數(shù)生長期內(nèi)表達(dá)，當(dāng)菌體進入穩(wěn)定期后便自動關(guān)閉，UBI4的表達(dá)時序與前三種基因恰好相反，這說明四種基因編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能并不完全相同。第一類基因包括UBC4、UBC5和UBC7，其編碼產(chǎn)物只擁有相應(yīng)的保守結(jié)構(gòu)域，多肽序列的其它區(qū)域并沒有明顯的同源性，這些蛋白形成泛蛋白-靶蛋白共價接合物的活性嚴(yán)格依賴于E3蛋白的存在；幾個編碼泛蛋白因子接合酶系統(tǒng)的酵母菌基因（UBC）第二類基因包括UBC1、UBC2、UBC3和UBC6，它們的表達(dá)產(chǎn)物具有天然的C端延伸活性，不需要E2蛋白的參與便可進行泛蛋白的接合反應(yīng)。如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物在酵母菌中具有對泛蛋白依賴型降解作用的敏感性，則可通過下列方法使這種降解作用減少到最低程度：第一種方法是以分泌的形式表達(dá)重組異源蛋白，異源蛋白在與泛蛋白因子形成共價結(jié)合物之前，迅速被轉(zhuǎn)位到分泌器中，即可有效避免降解作用；第二種方法是將外源基因的表達(dá)置于一個可誘導(dǎo)的啟動子控制之下，由于異源蛋白質(zhì)在短期內(nèi)集中表達(dá)，分子數(shù)占絕對優(yōu)勢的表達(dá)產(chǎn)物便能逃脫泛蛋白因子的束縛，從而減少由降解效應(yīng)帶來的損失；第三種方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突變株作為外源基因表達(dá)的受體細(xì)胞。UBI4缺陷型：在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達(dá)，UBI4-突變株正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體。減少泛蛋白因子依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌：泛素降解途徑衰減的釀酒酵母UBA1缺陷型：UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。Ubc4-ubc5雙突變型：七個泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效。內(nèi)源性蛋白酶缺陷型的突變受體菌

釀酒酵母擁有二十多種蛋白酶，盡管不是所有的蛋白酶都能降解外源基因表達(dá)產(chǎn)物，但實驗結(jié)果表明有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。將大腸桿菌的lacZ作為報告基因分別導(dǎo)入兩株具有相同遺傳背景的釀酒酵母菌中，其中一株含有編碼空泡蛋白酶基因PEP4的野生型菌株，另一株則為pep4-3突變株，比較這兩株菌中b-半乳糖苷酶的活性，在同等試驗條件下pep4-3突變株中的b-半乳糖苷酶活性明顯高于PEP4+的野生菌，而且在間歇式發(fā)酵罐中，pep4-3突變株也能長到相當(dāng)高的密度。PEP4蛋白酶除了具有降解蛋白質(zhì)的功能外，還能對某些重組異源蛋白進行加工。例如，MFa1-人神經(jīng)生長因子（hNGF）原前體的融合蛋白只能在pep4突變株細(xì)胞中進行正確的加工剪切，這說明PEP4蛋白酶或者細(xì)胞內(nèi)其它一些被PEP4蛋白酶激活和修飾的蛋白酶系統(tǒng)與重組異源蛋白的正確加工剪切過程有關(guān)。第三節(jié)、酵母菌的載體系統(tǒng)載體的一般結(jié)構(gòu)：選擇標(biāo)記復(fù)制子表達(dá)盒啟動子先導(dǎo)序列終止子有用的蛋白結(jié)構(gòu)域酵母菌種的野生型質(zhì)粒釀酒酵母中的2μ環(huán)狀質(zhì)粒幾乎所有的釀酒酵母都含有2μ雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)維持50-100個。Irs反向重復(fù)序列600bp，重組FLP編碼產(chǎn)物驅(qū)動Irs的同源重組，REP編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性，STB是REP的結(jié)合位點。接合酵母屬中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1以及克魯維酵母屬中的pKD1質(zhì)粒等，均有類似的結(jié)構(gòu)。

乳酸克魯維酵母中的線性質(zhì)粒乳酸克魯維酵母中含有兩種不同的雙鏈線性質(zhì)粒pGKL1和pGKL2，拷貝數(shù)為50-100個，分別攜帶K1和K2兩種能致死宿主細(xì)胞的毒素蛋白基因。酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)，可使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴增；酵母克隆表達(dá)質(zhì)粒的特點：含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記一般能和酵母相應(yīng)的突變體互補，如Leu+、His+、Ura+、Trp+等，有些還攜帶用于大腸桿菌的抗生素抗性標(biāo)記；含有合適的限制酶切位點，以便外源基因的插入。ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，大小在0.8-1.5Kb,染色體上每30-40bp就有一個ARS元件。含有ARS的YRp和YEp質(zhì)粒及其構(gòu)建由染色體ARS構(gòu)成的質(zhì)粒稱為YRp，而由2μ質(zhì)粒構(gòu)建的雜合質(zhì)粒為YEp。上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個，但是經(jīng)過幾代培養(yǎng)后，質(zhì)粒丟失率達(dá)50%-70%，主要由于分配不均勻所致。CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列。將CEN插入到ARS質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp。YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)通常只有1-5個。含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件構(gòu)建人工酵母染色體，可以克隆擴增大片段的外源DNA，這是構(gòu)建YAC載體的基本思路YAC載體的裝載量可高達(dá)800kb，適用于構(gòu)建人的基因組文庫。含有TEL的YAC質(zhì)粒的構(gòu)建整合型質(zhì)粒載體YIP及其構(gòu)建YIP載體由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段組成，可與受體或宿主的染色體DNA同源重組，整合進入宿主染色體中，酵母片段只提供選擇性標(biāo)志，沒有復(fù)制起點。轉(zhuǎn)化率低（只有1-10轉(zhuǎn)化子/微克DNA），但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定，多用于遺傳分析。復(fù)制型質(zhì)粒載體YRP及其構(gòu)建同時含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，又稱穿梭載體；帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。優(yōu)缺點：轉(zhuǎn)化率高，拷貝也高，但不穩(wěn)定，易丟失。附加體型質(zhì)粒載體YEP及其構(gòu)建由大腸桿菌質(zhì)粒、2u質(zhì)粒以及酵母染色體的選擇標(biāo)記構(gòu)成。2u質(zhì)粒含有自主復(fù)制起始區(qū)（Ori）和STB區(qū)，STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定。對酵母基因很高的轉(zhuǎn)化活性，比YRP型載體更穩(wěn)定，拷貝數(shù)也高，是基因克隆中的常用載體。YEp13質(zhì)粒載體PYF92：酵母的2μ質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒酵母的His+基因酵母人工染色體載體（YAC）YAC載體是由酵母染色體中分離出來的DNA復(fù)制起始序列、著絲點、端粒以及酵母選擇性標(biāo)記組成的能自我復(fù)制的線性克隆載體。YAC載體是以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)，長度約11.4kb，帶有人工染色體所需的一切元件。每個YAC載體可以裝進100萬堿基以上的大片段DNA，比柯斯質(zhì)粒的裝載能力要大得多。復(fù)制元件：YAC載體的復(fù)制元件是其核心組成成分自主復(fù)制序列用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒兩個端粒標(biāo)記基因：主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，Trp+、Leu+、His+、Ura+等第四節(jié)、酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酵母菌的轉(zhuǎn)化程序轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因酵母菌的轉(zhuǎn)化程序酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化法。在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)存活的原生質(zhì)球總數(shù)的1%-5%。但是操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。釀酒酵母的堿金屬細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA。堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對受電擊的細(xì)胞具有較大的負(fù)作用。其優(yōu)勢在于不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率高達(dá)105轉(zhuǎn)化子/μgDNA。酵母菌電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的命運單雙鏈DNA均可高效轉(zhuǎn)化酵母菌，但單鏈DNA的轉(zhuǎn)化率是雙鏈的10~30倍。含有酵母復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進入細(xì)胞后，能準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制。不含復(fù)制子的單鏈質(zhì)粒進入細(xì)胞后，能高效地同源整合入染色體，這對于體內(nèi)定點突變酵母基因組極為有利。同源重組的頻率取決于整合型質(zhì)粒與受體菌基因組之間的同源程度以及同源區(qū)域長度，一般來說，整合子占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的50~80%。用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因：營養(yǎng)缺陷型互補基因顯性基因營養(yǎng)缺陷型的互補基因營養(yǎng)缺陷型互補基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成基因如：Leu、Trp、His、Lys、Ura、Ade。但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難。顯性標(biāo)記基因顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型Aph氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶抗G418Cat氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗氯霉素Dhfr二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺Cup1銅離子螯合物耐受銅離子Suc2蔗糖轉(zhuǎn)化酶耐受高濃度蔗糖Ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑第五節(jié)、酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)酵母菌啟動子的基本特征和選擇用于啟動轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的酵母菌Ⅱ型啟動子的特征：基本區(qū)調(diào)控區(qū)TATA盒轉(zhuǎn)錄起始位點。上游激活系列（UAS）上游阻遏序列（URS）利用啟動子探針質(zhì)?？蓮慕湍妇蚪M中克隆和篩選具有特殊活性的強啟動子；從已有的啟動子中構(gòu)建雜合啟動子。利用啟動子探針質(zhì)?？蓮慕湍妇蚪M中克隆和篩選具有特殊活性的強啟動子，所使用的無啟動子報告基因為皰疹單純病毒的胸腺嘧啶激酶基因（HSV1-TK）。Thd+ATP→TMP+ADPTK利用氨甲喋呤和對氨基苯磺酰胺抑制其dTMP的生物合成。將HSV1-TK基因與pJDB207重組構(gòu)建一個啟動子探針質(zhì)粒，在TK基因上游的單一限制性酶切口處插入隨機斷裂的酵母菌基因組DNA片段，從含有氨甲喋呤、對氨基苯磺酰胺以胸腺嘧啶的選擇培養(yǎng)基上即可獲得含有啟動子活性片段的陽性轉(zhuǎn)化子。將釀酒酵母的乙醇脫氫酶Ⅱ基因（ADH2）所屬啟動子的上游調(diào)控區(qū)與甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）所屬啟動子的下游基本區(qū)重組在一起，構(gòu)建出ADH2-GADPH型雜合啟動子。ADH2啟動子為葡萄糖阻遏并可用乙醇誘導(dǎo)，而GADPH啟動子是釀酒酵母細(xì)胞中最強的組成型表達(dá)啟動子。雜合啟動子另一個相似的雜合啟動子由丙糖磷酸異構(gòu)酶（TPI）基因的強啟動子和一個溫度依賴型阻遏系統(tǒng)（sir3-8ts-MATa2）的操作子序列構(gòu)成，這種雜合啟動子的一個顯著特征是可用溫度誘導(dǎo)表達(dá)外源基因。酵母菌啟動子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)溫度控制性啟動子酵母交配型轉(zhuǎn)變

酵母有兩種交配類型a和α，單倍體孢子a和α之間交配才產(chǎn)生a/α二倍體，經(jīng)減數(shù)分裂及產(chǎn)孢過程形成4個單倍體孢子；相同交配型的單倍體孢子之間不能發(fā)生交配。釀酒酵母的a和α兩種單倍體，分別由MATa和MATα兩種等位基因決定。MATα由順反子MATα1和MATα2組成，前者決定α1的激活過程，后者決定α2阻遏過程。MATa中，a1和a2蛋白共同決定a1-a2阻遏交配型轉(zhuǎn)換的遺傳基礎(chǔ)：控制交配型的MAT基因位于第3染色體上，MATa：a交配型，MATα：α交配型；兩基因互為等位基因；在MAT基因兩端有同源序列HMLα和HMRa，由于兩基因上游存在沉默子，故不表達(dá)，但可分別與MATα、MATa基因序列相同。遺傳學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了4個不連鎖的基因沉默交配型調(diào)節(jié)基因，SIR（silentinformationregulator）1、2、3和4，這些基因產(chǎn)物共同起反式作用（它們并不在同一條的染色體上）來阻止沉默交配型基因的表達(dá)。若這4個SIR基因中任何一個基因失去作用的話，那么HMLα和HMRa基因就會以MAT座位上的基因相同的速率進行轉(zhuǎn)錄。利用上述細(xì)胞類型決定簇的兩種特異性突變基因可以構(gòu)建對克隆的外源基因表達(dá)進行溫度控制的二元系統(tǒng)：溫度敏感型突變體sir3-8ts。α2蛋白的突變體hmlα2-102---導(dǎo)致它在與a1蛋白交配時對MATα順反子阻遏活性的喪失，但仍保留a-特異性基因的能力。因此具有MATa-hmlα2-102-HMRa-sir3-8ts基因型的酵母細(xì)胞在25℃培養(yǎng)時，應(yīng)具有a交配類型，因為此時只有MATa基因能表達(dá)，hmlα2-102和HMRa均為Sir蛋白所阻遏。當(dāng)細(xì)胞生長在35℃時，MAT、HML和HMR基因均能表達(dá)，只有α2基因被阻遏，因此細(xì)胞呈現(xiàn)α交配型。當(dāng)外源基因置于a-特異性基因的啟動子控制之下時，a交配型的受體細(xì)胞在25℃時可以表達(dá)該基因，但在35℃時不表達(dá)。上述系統(tǒng)為外源基因的表達(dá)提供了一種二元調(diào)控模式：a型啟動子如果外源基因與α-特異性基因的啟動子重組，則僅在35℃時表達(dá)，而在25℃不表達(dá)。α型啟動子超誘導(dǎo)型啟動子當(dāng)釀酒酵母生長在無半乳糖存在的培養(yǎng)基時，其GAL1、GAL7、GAL10啟動子受到阻遏；加入半乳糖時，啟動子活性被誘導(dǎo)1000倍。嚴(yán)緊控制表達(dá)系統(tǒng)：啟動子受某種因素的調(diào)節(jié)，使其表達(dá)控制在一定的水平。一種以人雄激素受體為中心的嚴(yán)緊控制表達(dá)系統(tǒng)能有效地將外源基因的表達(dá)水平控制在一個合適的范圍。此系統(tǒng)中，雄激素受體表達(dá)水平、雄激素濃度以及重組質(zhì)?？截悢?shù)三者之間的平衡，可以有效作用于對雄激素具有應(yīng)答能力的啟動子。外源基因在酵母菌種表達(dá)的限制性因素外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度外源基因mRNA的翻譯活性酵母菌對密碼子的偏愛性---在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼的外源基因穩(wěn)定態(tài)mRNA的半衰期酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)

釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來彌補。乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌性的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長迅速；乙醇氧化酶基因AOX1所屬強啟動子；表達(dá)的可誘導(dǎo)性。三大優(yōu)勢：由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體，與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細(xì)胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性。HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多個拷貝。重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。第五節(jié)、酵母菌的蛋白修飾分泌系統(tǒng)蛋白質(zhì)的分泌運輸機制與其他高等真核生物相似，高度分化的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)在酵母菌蛋白分泌運輸過程中起著重要作用。酵母菌的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)信號肽及其剪切系統(tǒng)與其他真核生物相似，酵母菌信號肽序列的保守性較低，大都由15-30個氨基酸殘基組成，含有三個不同的結(jié)構(gòu)特征，即N端帶正電荷的n區(qū)，中間疏水殘基的h區(qū)，C端極性的c區(qū)。N端帶正電荷的n區(qū)的長度及氨基酸殘基性質(zhì)各異，都含正電荷。中間疏水殘基的h區(qū)的疏水氨基酸殘基大都隨機排列。C端極性的c區(qū)具有對應(yīng)于信號肽剪切位點的特征序列。分泌型蛋白的糖基化修飾酵母菌中的蛋白質(zhì)糖基化修飾有兩個主要步驟：在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中的寡聚多糖核裝配在高爾基體中的糖外鏈延伸。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中的寡聚多糖核裝配在高爾基體中的糖外鏈延伸進入高爾基體的分泌型蛋白在其寡聚多糖核上進行外鏈的延伸反應(yīng)。酵母菌的修飾形式不同于高等真核生物。重組異源蛋白在酵母菌受體細(xì)胞中的超糖基化會造成重組蛋白的生物活性降低以及蛋白質(zhì)的免疫原性增加等。第七節(jié)、利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗乙肝肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感染能力的病毒顆粒，直徑42nm，基因組僅為3.2kb。病毒的主要結(jié)構(gòu)：蛋白病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式，顆粒內(nèi)的蛋白成分包括核心抗原、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。表面抗原乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母20世紀(jì)80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結(jié)構(gòu)和