分子生物學-質粒課件

分子生物學李松2023/7/291質粒2用于基因克隆的載體質粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）

具有合適的篩選標記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點質粒的基本特征質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質粒常見于原核細菌和真菌中絕大多數(shù)的質粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA）質粒DNA的分子量范圍：1-300kb質粒的自主復制性質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簢谰o型復制控制的質粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復制控制的質粒10-60拷貝stringentplasmid質粒的不相容性任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質粒的不相容性，不相容性的質以大腸桿菌的質粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結構，彼此不相容p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容粒組成不相容性群。質粒的不相容性：分子機制兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復制子結構的不同質粒，在復制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調節(jié)，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內。其中拷貝數(shù)多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。質粒的可轉移性革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩大類：接合型質粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等；如Col、R的其它成員；非接合型質粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定攜帶特殊的遺傳標記野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義質粒的構建天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數(shù)幾個野生型質粒構建的：pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內毒素標記基因E1RSF2124ColE1衍生質粒氨芐青霉素抗性標記基因Apr人工構建的質粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質粒突變拷貝數(shù)控制基因拷貝數(shù)1000-3000擴增基因低拷貝質粒來自pSC101拷貝數(shù)小于10

表達某些毒性基因溫敏質粒在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質測序質粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質粒裝有整合促進基因及位點便于外源基因的整合穿梭質粒裝有針對兩種不同受體的復制子便于基因克隆表達質粒裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件探針質粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選重要的大腸桿菌質粒載體松弛型復制pBR322：氯霉素可擴增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’質粒表達型質粒載體的結構172023/7/29常用克隆載體類型：T-載體，pUC系列，pMD系列，一些表達型質粒特點：功能單位小，拷貝數(shù)多182023/7/29T-vector192023/7/29BluewhiteScreen202023/7/29212023/7/29常用表達系統(tǒng)原核細胞：大腸桿菌、芽孢桿菌等真核細胞：絲狀真菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等質粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間堿溶法：

用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內含物

加高濃度的醋酸鉀溶液